Кодируемые бактериофагами ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Получение ДНК-матрицы

РНК-полимеразы катализируют полимеризацию рибонуклео-зидтрифосфатов (rNTP) с образованием РНК, используя в качестве матрицы ДНК. РНК-полимеразы, кодируемые бактериофагами Е. coli (такими, как Т7, Т3, SP6), могут распознавать только фаговые промоторы, но не бактериальные, плазмидные или эукариотические, которые могут присутствовать в клонированных последовательностях ДНК. Поэтому их можно использовать для синтеза специфичных одноцепочечных молекул РНК in vitro.

Чтобы осуществить транскрипцию специфической ДНК-матрицы, ее нужно встроить в специальный вектор с 3-стороны от подходящего фагового промотора. Необходимость в особом клонировании привела к созданию векторов, в которых фаговый промотор находится с 5 -стороны от множественного сайта клонирования, например pSP70, pBIuescribe и pBluescript (Stratagene), pGEM (Promega, Madison). Выбор вектора в основном определяется личными предпочтениями исследователя. Если необходимо получить транскрипты обеих цепей матрицы (т. е. синтезировать и смысловую, и антисмысловую РНК), то целесообразно выбрать вектор с двумя разными фаговыми промоторами, а не встраивать ДНК-матрицу в разных ориентациях в плазмиду с одним промотором.

Это имеет большое значение при получении зондов для гибридизации in situ, поскольку смысловая РНК используется при локализации специфических мРНК в качестве отрицательного контроля.

Важно определить положение сайтов рестрикции как в самой ДНК-матрице, так и с 3 -стороны от нее. Если 5 -конец транскрипта задается фаговым промотором, то его второй конец определяется выбранным для расщепления эндонуклеазой сайтом в 3'-половине ДНК-вставки. Лучше использовать рестриктирующие эндонуклеазы, дающие тупые или 5 -выступающие липкие концы, поскольку РНК-полимеразы способны осуществлять обратную транскрипцию с 3-выступающих липких концов с образованием транскриптов, комплементарных зонду, который намереваются получить.

бактериофаговские днк

Получение ДНК-матрицы

Работая с препаратами РНК, необходимо принять все меры для предотвращения загрязнения используемых растворов РНКазами. Все операции следует проводить в перчатках, а растворы обрабатывать ДЭПК. Для этого в растворы добавляют ДЭПК до 0,1% (о/о), выдерживают их в течение 1 ч и автоклавируют для разложения ДЭПК. Такой способ непригоден для буферов, содержащих трис. Эти буферы готовят на обработанной ДЭПК воде и автоклавируют. Плазмидную ДНК для дальнейшей транскрипции лучше всего получать центрифугированием в градиенте плотности. Однако можно использовать и плазмиды, выделенные с помощью одного из микрометодов.

Очень важно, чтобы ДНК-матрица была в нужной степени ре-стрицирована: сверхспиральная ДНК является высокоэффективной матрицей для всех фаговых РНК-полимераз, что приводит к образованию очень длинных транскриптов.
После эндонуклеазной обработки ДНК очищают экстракцией фенолом и хлороформом с последующим переосаждением этанолом.

Общий метод очистки нуклеиновых кислот от белков

1. Экстракция фенолом Добавляют к раствору ДНК или РНК равный объем фенола, насыщенного ТЭ, перемешивают переворачиванием до образования гомогенной смеси и разделяют фазы центрифугированием на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 10 мин. Осторожно отбирают пипеткой верхнюю (водную) фазу и переносят ее в чистую пробирку.
2. Экстракция фенолом : хлороформом
К полученной на этапе 1 водной фазе добавляют равный объем смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25 : 24 : 1, о/о). Для этого сначала готовят раствор хлороформ:изоамиловый спирт (24 ; 1, о/о), а затем добавляют его в соотношении 1 : 1 к насыщенному буфером фенолу. Перемешивают фазы и разделяют их, как это описано в п. 1.

3. Экстракция хлороформом
Полученную на этапе 2 водную фазу экстрагируют равным объемом смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1) и разделяют фазы, как это описано в п. 1.

4. Переосаждение этанолом
Добавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия, рН 4,5, и два объема этанола к полученной на этапе 3 водной фазе, перемешивают и охлаждают при —70 С или в сухом льду. Собирают нуклеиновые кислоты центрифугированием на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 10 мин. Осторожно отбирают супернатант, промывают осадок 70% этанолом при комнатной температуре и повторяют центрифугирование, как описано выше. Максимально полно отбирают супернатант, осадок подсушивают на воздухе и растворяют в необходимом количестве буфера ТЭ.

Метод транскрипции in vitro для получения полноразмерных UТР-РНК-зондов с высокой удельной радиоактивностью описан в протоколе. Там же приведены методы нерадиоактивного мечения с помощью биотина и дигоксигенина.

- Читать далее "Получение РНК-зондов. Нерадиоактивное мечение РНК зондов"

Оглавление темы "Мечение нуклеиновых кислот":
1. Основные методы мечения нуклеиновых кислот. Определение уровня включения нуклеотидтрифосфатов в ДНК
2. Очистка от невключившихся нуклеотидов. Центрифугирование на колонках с сефадексом
3. Мечение двухцепочечной ДНК. Метод нуклеотидного замещения
4. Метод рассеянной затравки двухцепочечной ДНК. Получение меченых зондов методом рассеянной затравки
5. Мечение ДНК с использованием фрагментов. Получение зондов с помощью ПЦР
6. Температура получения меченых зондов. Технология получения меченных зондов с помощью ПЦР
7. Кодируемые бактериофагами ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Получение ДНК-матрицы
8. Получение РНК-зондов. Нерадиоактивное мечение РНК зондов
9. Преимущества РНК-зондов. Типы олигонуклеотидных зондов и их применение
10. Мечение 5'-концов. Мечение 5-концов при участии полинуклеотидкиназы фага Т4

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: