Мечение 5'-концов. Мечение 5-концов при участии полинуклеотидкиназы фага Т4

На 5-конце синтезированных олигонуклеотидов отсутствует фосфатная группа, поэтому обычно их метят с помощью АТР фосфорилированием 5 -конца при участии полинуклеотидкиназы фага Т4. В результате у олигонуклеотида оказывается помечен всего один нуклеотид, и удельная радиоактивность зонда оказывается существенно ниже, чем при мечении методами ник-трансляции, рассеянной затравки, ПЦР и транскрипции in vitro.

Само собой разумеется, что удельная радиоактивность олиго-зонда не может быть выше, чем у меченого нуклеотида, поэтому для концевого мечения обычно используются кР-нуклеотиды.

Очень важно хорошо очистить меченые олигонуклеотиды от невключившегося АТР и быть уверенным в том, что гибридизации зонда с мишенью не мешают примеси немеченых олигонуклеотидов. Для очистки можно провести тонкослойную хроматографию или электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии 7 М мочевины.

Для получения олигонуклеотидов с 5-концом, помеченным нерадиоактивной меткой, к 5 -концу присоединяют аминогруппу, с которой затем в ходе химической (а не ферментативной) реакции легко связывается биотин. Этот метод описан в работе.

Мечение 5-концов при участии полинуклеотидкиназы фага Т4

Материалы
• Олигонуклеотид (примерно 0,1 мкг, если длина олигонуклео-тида — 19 звеньев)
• 10 х киназный буфер (10 х КБ): 500 мМ трис-HCl, рН 7,6, 100 мМ MgCb, 50 мМ ДТТ, 1 мМ спермидин
• Полинуклеотидкиназа Т4: 4 ЕД/мкл
• АТР (удельная радиоактивность 3000 Ки/ммоль; 110 ТБк/ммоль; 10 мкКи/мкл)

мечение 5-х концов олигонуклеотидов

Методика
1. В помещенную в лед микроцентрифужную пробирку на 0,5 мл вносят реактивы в следующем порядке:
• Олигонуклеотид 1 мкл (15 пмолей 5-концов)
• Вода до конечного объема 10 мкл
• 10 х КБ 1 мкл
• АТР 1мкл (примерно 150 мкКи)
• Полинуклеотидкиназа Т4 1 мкл (4 ЕД)

Осторожно перемешивают реакционную смесь медленным пипетированием. Центрифугируют при 12 000 g в течение 2 с в микроцентрифуге.

2. Выдерживают при 37 С в течение 45 мин.
3. Невключившиеся нуклеотиды удаляют с помощью фильтрации на сефадексе G-50, гель-электрофореза, ЖХВР или ТСХ.
- Меченый нуклеотид необходимо высушить и вновь растворить в 1 или 2 мкл воды с тем, чтобы провести реакцию в минимальном объеме для последующей очистки олиго-зонда с помощью гель-электрофореза.

Для 5-концевого мечения может использоваться также ATP, но для достижения высокой скорости реакции необходима более высокая концентрация киназы. 35S-олиго-зонды можно использовать для гибридизации in situ.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."

Оглавление темы "Мечение нуклеиновых кислот":
1. Основные методы мечения нуклеиновых кислот. Определение уровня включения нуклеотидтрифосфатов в ДНК
2. Очистка от невключившихся нуклеотидов. Центрифугирование на колонках с сефадексом
3. Мечение двухцепочечной ДНК. Метод нуклеотидного замещения
4. Метод рассеянной затравки двухцепочечной ДНК. Получение меченых зондов методом рассеянной затравки
5. Мечение ДНК с использованием фрагментов. Получение зондов с помощью ПЦР
6. Температура получения меченых зондов. Технология получения меченных зондов с помощью ПЦР
7. Кодируемые бактериофагами ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Получение ДНК-матрицы
8. Получение РНК-зондов. Нерадиоактивное мечение РНК зондов
9. Преимущества РНК-зондов. Типы олигонуклеотидных зондов и их применение
10. Мечение 5'-концов. Мечение 5-концов при участии полинуклеотидкиназы фага Т4

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: