Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК

1. Инокулируют 30 мл среды LB (содержащей соответствующий антибиотик) 1/100 ее объема (300 мкл) ночной культуры, полученной из одной бактериальной колонии, содержащей интересующую плазмиду.
Выращивают бактериальную культуру при 37 С со встряхиванием (200 об/мин) до поздней логарифмической фазы (для достижения ОД600 ~ 0,6 необходимо 2-3 ч).

2. Инокулируют 500 мл нагретой до 37 С и содержащей соответствующий антибиотик среды LB, налитой в колбу на 2 л, 25 мл культуры, полученной на первом этапе. Инкубируют при 37 С при интенсивном встряхивании (200 об/мин) в течение 2,5 ч. ОД600 по окончании инкубации должно составлять ~ 1,0.
• Дополнительный этап: для выделения низкокопийных плазмид (типа pBR322) к культуре добавляют 2,5 мл хлорамфеникола (34 мг/мл в этаноле) до конечной концентрации в культуре 170 мкг/мл.

3. Растят культуру еще 12—16 ч (обычно в течение ночи) при 37 °С при интенсивном встряхивании (200 об/мин).
4. Собирают бактериальные клетки центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин (ротор Sorvall GSA или его аналог). Сливают супернатант, центрифужные стаканы переворачивают и дают супернатанту полностью стечь.

5. Ресуспендируют при встряхивании осадок бактериальных клеток в 10 мл содержащего лизоцим (2 мг/мл) буфера I и инкубируют их 10 мин во льду.
6. Добавляют 20 мл раствора II, закрывают центрифужный стакан и тщательно перемешивают его содержимое, несколько раз перевернув стакан. Инкубируют 5 мин во льду.

плазмидная ДНК

7. Добавляют 20 мл холодного раствора III, закрывают центрифужный стакан и тщательно перемешивают его содержимое встряхиванием. Инкубируют во льду от 10 до 20 мин. За это время должен образоваться рыхлый белый осадок, содержащий хромосомную ДНК, РНК и белково-мембранные комплексы.
8. Бактериальный лизат центрифугируют при 10 000 g в течение 10 мин при 4°С (ротор GS3 или его аналог).

9. Супернатант фильтруют через марлю в центрифужный стакан на 250 мл, добавляют 0,6 объема изопропанола, хорошо перемешивают и для образования осадка нуклеиновых кислот помещают на -20 С на 20 мин.
10. Осадок нуклеиновых кислот собирают центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин при 4 С (ротор Sorvall GS3 или его аналог).

11. Осторожно сливают супернатант, переворачивают пробирку и дают полностью стечь супернатанту (примерно 30 мин при комнатной температуре).
12. Растворяют осадок нуклеиновых кислот в 8,8 мл ТЭ.

13. К 8,8 мл ресуспендированного осадка добавляют сухой CsCI из расчета 1 г на 1 мл раствора ДНК, аккуратно перемешивают до растворения CsCl, добавляют 0,4 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл в воде),

14. С помощью пастеровской пипетки или одноразового шприца переносят красный прозрачный раствор в быстрозаплавляемую пробирку Beckman (или аналогичную) и заполняют ее доверху легким минеральным маслом. Заплавляют пробирку согласно указаниям фирмы-изготовителя и центрифугируют при 100 000 g в течение 40 ч при 20 С (например, в роторе Beckman 50Ti). Можно использовать угловые и вертикальные роторы других фирм (например, Beckman 70Ti; в этом случае центрифугирование проводят при 250 000 g в течение 16 ч). Пробирки должны быть уравновешены с точностью до 0,02 г.

15. Чтобы отобрать плазмидную ДНК, прокалывают верхнюю часть пробирки с помощью иглы для подкожных инъекций № 19, чтобы в пробирку вошел воздух. Затем вводят иглу № 21, надетую на шприц на 2 мл (скошенной стороной вверх), в нижнюю окрашенную в красный цвет зону, отбирают плазмидную ДНК и переносят ее в стерильную пробирку. Если количество плазмидной ДНК невелико, то для ее визуализации пробирку освещают длинноволновым УФ-светом.

16. Бромистый этидий экстрагируют с помощью насыщенного водой изобутилового спирта. Для этого к раствору плазмидной ДНК добавляют равный объем насыщенного изобутилового спирта, перемешивают и отбирают верхний слой. Операцию повторяют до тех пор, пока изобутиловый спирт не перестанет окрашиваться.

17. Для удаления из раствора ДНК CsCl добавляют равное количество воды и переосаждают ДНК двумя объемами этанола при 4 С в течение 15 мин. Плазмидную ДНК собирают центрифугированием при 10 000 g в течение 15 мин при 4 °С (ротор Sorvall SS34 или его аналог); осадок ДНК растворяют примерно в 1 мл ТЭ. Определяют ОД260 конечного раствора ДНК и рассчитывают его концентрацию. Разливают раствор ДНК на аликвоты и хранят при —20 °С.
- Состав этих растворов приведен в протоколе. - Состав этих растворов приведен в протоколе. - Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА.

- Читать далее "Мечение нуклеиновых кислот. Разновидности мечения нуклеиновых кислот"

Оглавление темы "Выделение ДНК и РНК. Плазмиды":
1. Одновременное выделение ДНК и РНК. Техника одновременного выделения ДНК и РНК
2. Очистка poly(A)+-PHK. Выделение poly(A)+-PHK
3. Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле
4. Электрофорез РНК в формальдегидном геле. Количественный анализ нуклеиновых кислот
5. Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды
6. Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами
7. Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК
8. Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры
9. Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК
10. Мечение нуклеиновых кислот. Разновидности мечения нуклеиновых кислот

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: