Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле

После выделения ДНК и/или РНК и до проведения дальнейших исследований необходимо определить чистоту препаратов и размер молекул. Загрязняющие примеси в препаратах нуклеиновых кислот могут ингибировать последующие ферментативные реакции с их участием (например, рестрикцию ДНК). При наличии загрязнений повторно проводят обработку протеиназой К и экстракцию фенолом/хлороформом; обычно этого бывает достаточно. Если препараты РНК предполагается использовать только для Нозерн-блот-гибридизации, то дополнительная ферментативная обработка не требуется. ДНК должна быть достаточно высокомолекулярной, чтобы можно было проводить планируемые эксперименты, а РНК — интактной.

Качественный анализ

ДНК и РНК (одно- и двухцепочечные) движутся в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молекулярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем двухцепочечные той же длины. Поскольку молекулярная масса нуклеиновых кислот пропорциональна их длине (в парах нуклеотидов или в тысячах пар нуклеотидов), можно построить стандартную кривую зависимости расстояния, на которое перемещается маркерный фрагмент, от десятичного логарифма длины этого фрагмента, и с ее помощью определять размеры фрагментов нуклеиновых кислот в данном препарате по расстоянию, на которое они перемещаются.

Гель-электрофорез РНК

Для предварительной оценки степени деградации РНК можно провести ее электрофорез в агарозном геле в ТБЭ. В препаратах РНК хорошего качества содержание 28S-PHK должно быть примерно в три раза выше, чем 18S-PHK. Если это отношение меньше, значит, РНК частично деградирована. Для более точной оценки качества образцов нужно провести гель-электрофорез денатурированной РНК или электрофорез в денатурирующих гелях. Эти два метода описаны соответственно в протоколах.

Материалы
Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• 6 М глиоксаль: глиоксаль обычно поставляют в виде 40% (6 М) раствора. Поскольку глиоксаль быстро окисляется на воздухе, перед использованием его деионизуют с помошью катионо-обменной и анионообменной смол (например, Bio-Rad AG 501-Х8), перемешивая глиоксаль вместе со смолами на орбитальном шейкере до достижения рН менее 5,0, Деионизован-ный глиоксаль хранят разлитым на аликвоты в плотно закрытых пробирках при —20 °С. Пробирки должны быть заполнены максимально полно и каждую аликвоту можно использовать только один раз
• ДМСО: обычно высококачественный ДМСО можно использовать в том виде, в каком он поступает от фирмы, без какой-либо дополнительной обработки. Тем не менее бутыль со свежим ДМСО лучше разлить на аликвоты и хранить при —20 "С. Каждую аликвоту необходимо использовать только один раз
• 10 х буфер для электрофореза: 100 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,0
• Смесь для денатурации: 3 мл 6 М глиоксаля, 7,5 мл ДМСО и 1,5 мл 10 х буфера для электрофореза. Эту смесь хранят разлитой на аликвоты в плотно закрытых пробирках при —20 СС. Пробирки должны быть заполнены практически полностью и использоваться только один раз
• Буфер для нанесения: 50% глицерин, 0,25% бромфеноловый синий в 1 х буфере для электрофореза
• Агароза (для электрофореза)

анализ рнк

Методика
1. Растворяют каждый образец РНК (содержащий примерно 20 мкг РНК) в 3 мкл обработанной ДЭПК воды и добавляют 12 мкл смеси для денатурации.
2. Денатурируют РНК прогреванием при 50 °С в течение 1 ч.
3. Готовят 1,1% (в/о) агарозный гель в 1 х буфере для электрофореза и охлаждают его до 70 С. Для инактивации РНКаз добавляют в гель сухой иодацетат натрия до конечной концентрации 10 мМ.
4. Охлаждают смесь до примерно 50 С, выливают в кювету и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

5. Добавляют к каждому образцу РНК 2,5 мкл буфера для нанесения, осторожно перемешивают и быстро центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g.
6. Вносят образцы в лунки агарозного геля и проводят электрофорез при градиенте напряженности 1—2 В/см в 1 х буфере для электрофореза. Во время электрофореза должна быть обеспечена рециркуляция буфера, чтобы его рН поддерживался на уровне 7,0, поскольку при рН 8,0 комплекс глиоксаль/РНК диссоциирует.
7. Когда бромфеноловый синий дойдет до конца геля, электрофорез останавливают и окрашивают гель бромистым этидием (0,5 мкг/мл в 25 мМ трис-HCl, рН 9,0) в течение 1 ч при осторожном покачивании. При сильном фоновом окрашивании лишний бромистый этидий можно отмыть водой (две смены по 30 мин каждая).
8. Просматривают гель в УФ-трансиллюминаторе и фотографируют его фотоаппаратом «Поляроид».

- Важно полностью денатурировать РНК до электрофореза и поддерживать ее в таком состоянии во время его проведения, поскольку электрофоретическая подвижность РНК изменяется при образовании вторичной структуры. Чтобы электрофорез прошел успешно, необходимы качественные реактивы, использующиеся при приготовлении смеси для денатурации, и постоянная циркуляция буфера во время проведения электрофореза.
- Глиоксаль реагирует с бромистым этидием, поэтому при приготовлении геля и проведении электрофореза данный краситель не используют.
- Для препаратов интактной РНК интенсивность флуоресценции полосы, отвечающей 28S-PHK, должна быть как минимум в два раза выше, чем у полосы 18S-PHK.

- Читать далее "Электрофорез РНК в формальдегидном геле. Количественный анализ нуклеиновых кислот"

Оглавление темы "Выделение ДНК и РНК. Плазмиды":
1. Одновременное выделение ДНК и РНК. Техника одновременного выделения ДНК и РНК
2. Очистка poly(A)+-PHK. Выделение poly(A)+-PHK
3. Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле
4. Электрофорез РНК в формальдегидном геле. Количественный анализ нуклеиновых кислот
5. Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды
6. Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами
7. Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК
8. Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры
9. Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК
10. Мечение нуклеиновых кислот. Разновидности мечения нуклеиновых кислот

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: