Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды

• ТЭ-буфер: 10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0
• Раствор бромистого этидия: 1 мкг/мл в ТЭ

Методика
1. Готовят серию разведений образца ДНК или РНК и соответствующих стандартных растворов в буфере ТЭ и добавляют ко всем разведениям равный объем раствора бромистого этидия.
2. На трансиллюминатор кладут кусочек пластиковой пленки (типа Saran).
3. На пленку наносят по 5 мкл каждого разведения образца и стандартного раствора.
4. Определяют концентрацию образца, сравнивая интенсивности флуоресценции стандартного раствора и разведений. Для облегчения оценки можно сфотографировать пленку.

концентрация днк

Хранение нуклеиновых кислот:
• РНК необходимо хранить при -70 С в 70% этаноле,
• Для непродолжительного хранения ДНК достаточно температуры 4 °С, для долговременного более предпочтительна температура —70 С. В то же время повреждение ДНК свободными радикалами может быть сильнее при —70 С.
• ДНК нельзя хранить при -20 "С, поскольку при этой температуре в ней образуется большое число одно- и двухцепочеч-ных разрывов. Разрывы возникают также при замораживании—оттаивании препаратов.

Бактериальные плазмиды

В последующих наших статьях описаны методы очистки рекомбинатных бактериальных плазмид и последующее мечение клонированных вставок—фрагментов ДНК (или их РНК-копий) с использованием различных ферментативных методов. Рассмотрены методы как изотопного, так и неизотопного мечения, проведен их сравнительный анализ.

Бактериальные плазмиды — это двухцепочечные кольцевые замкнутые молекулы ДНК, размер которых варьирует от 1 до 200 т.н. Их репликация и распределение между дочерними клетками не зависит от бактериальной хромосомы, хотя для репликации и транскрипции они используют кодируемые клеткой-хозяином белки и ферменты.

В природных условиях многие плазмиды передаются в новую клетку-хозяина при конъюгации. В лаборатории плазмидную ДНК можно ввести в бактериальную клетку с помощью искусственного процесса трансформации. Для этого клетку обрабатывают смесью двухвалентных катионов, и она временно становится проницаемой для малых молекул ДНК. Для отбора трансформантов используются кодируемые плазмидами селективные маркеры. Чаще всего это гены, которые обеспечивают устойчивость бактерий к антибиотикам, таким как тетрациклин и ампициллин.

За время развития генной инженерии размер плазмидных векторов для клонирования был уменьшен до минимума, с тем чтобы увеличить размер клонируемых фрагментов чужеродной ДНК, полученных с использованием широкого спектра рестриктаз. В настоящее время практически все векторы содержат так называемый «полилинкер», или поликлонируюший сайт — несколько тесно расположенных синтетических уникальных (не присутствующих в других частях вектора) сайтов для клонирования. Например, поликлонируюший сайт в векторе pUC19 состоит из последовательно расположенных сайтов узнавания для 14 рестриктаз. Включение полилинкера в ген, кодирующий биологически активную р-галактозидазу, приводит к тому, что встраивание чужеродной ДНК практически всегда сопровождается инактивацией этого фермента. При этом рекомбинантные клоны теряют способность гидролизовать хромогенный субстрат, 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-В-галактозид (X-gal), и могут быть отобраны из исходных клонов дикого типа с помощью гистохимического недеструктивного теста. Несущие рекомбинантные плазмиды бактерии образуют при этом колонии белого цвета, а исходные бактериальные клоны — голубого (этот процесс был назван а-комплементацией).

Помимо плазмидных векторов, дающих возможность проводить визуальную идентификацию рекомбинантных клонов с помощью гистохимических тестов, были созданы векторы, позволяющие получать одноцепочечные матрицы для секвенирования ДНК (например, векторы типа pUC и pBluescript), транскрибировать чужеродные последовательности ДНК in vitro (например, векторы типа pSP64/65 и его производные, векторы pBluescript/pBluesribe [Stratagene, San Diego, USA]) и синтезировать большие количества чужеродных белков.

- Читать далее "Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами"

Оглавление темы "Выделение ДНК и РНК. Плазмиды":
1. Одновременное выделение ДНК и РНК. Техника одновременного выделения ДНК и РНК
2. Очистка poly(A)+-PHK. Выделение poly(A)+-PHK
3. Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле
4. Электрофорез РНК в формальдегидном геле. Количественный анализ нуклеиновых кислот
5. Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды
6. Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами
7. Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК
8. Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры
9. Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК
10. Мечение нуклеиновых кислот. Разновидности мечения нуклеиновых кислот

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: