Очистка poly(A)+-PHK. Выделение poly(A)+-PHK

В буферах с высокой ионной силой poly(A)+-хвост полиаде-нилированной РНК образует комплекс с oligo(dT), ковалентно связанной с твердой матрицей (например, с целлюлозой). Это позволяет выделять мРНК из сложной популяции клеточных РНК. Если нанести на колонку с оligо(оТ)-целлюлозой суммарную клеточную РНК в буфере с высокой ионной силой, то на колонке задержится только poly(A)+-PHK, которую можно затем элюировать буфером с низкой ионной силой или водой и сконцентрировать переосаждением этанолом. Этот метод описан в протоколе.

Материалы
Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• 2 х буфер для нанесения: 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,2% (в/о) ДСН
• Oligо(аТ)-целлюлоза
• 5 М NaCl

Методика
1. Ресуспендируют 1 oligо(аТ)-целлюлозы в стерильной дистиллированной обработанной ДЭПК воде и набивают этой целлюлозой одноразовую колонку или шприц (объем упакованной колонки должен быть около 1 мл).
2. Промывают колонку горячей (65 °С) водой и 5 мл 1 х буфера для нанесения.
3. Растворяют образец РНК в 250 мкл воды, прогревают его 5 мин при 65 "С, быстро охлаждают до комнатной температуры и добавляют равный объем 2 х буфера для нанесения.
4. Наносят образец на колонку и сразу собирают элюат.

очистка рнк

5. Промывают колонку 1 мл буфера для нанесения и объединяют элюаты.
6. Прогревают суммарный элюат 5 мин при 65 °С, быстро охлаждают до 20 С и повторно наносят его на колонку.
7. Промывают колонку буфером для нанесения (10 раз по 1 мл) для полной элюции poly(A)— РНК.
8. Для элюции poly(A)+-PHK наносят на колонку 1,8 мл горячей (65 °С) воды и сразу собирают элюат.
9. Прогревают элюат 5 мин при 65 °С и быстро охлаждают его до комнатной температуры.

10. Добавляют 0,2 мл 5 М NaCl, наносят смесь на новую колонку и повторяют пп. 4-7.
11.Элюируют poly(A)+-PHK двумя порциями по 1 мл горячей (65 °С) воды.
12. Экстракцией изобутанолом концентрируют элюат до объема примерно 400 мкл.
13.Добавляют к образцу 2,5 объема этанола и хранят при —70 °С. 14.ро1у(А)+-РНК можно получить.

- Читать далее "Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле"

Оглавление темы "Выделение ДНК и РНК. Плазмиды":
1. Одновременное выделение ДНК и РНК. Техника одновременного выделения ДНК и РНК
2. Очистка poly(A)+-PHK. Выделение poly(A)+-PHK
3. Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле
4. Электрофорез РНК в формальдегидном геле. Количественный анализ нуклеиновых кислот
5. Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды
6. Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами
7. Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК
8. Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры
9. Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК
10. Мечение нуклеиновых кислот. Разновидности мечения нуклеиновых кислот

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: