Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК

Для выделения плазмид разработано несколько методов. Они различаются по чистоте конечного продукта, скорости выделения и возможности их использования для выделения плазмид из большого («maxiprep») и промежуточного («midiprep») объемов бактериальной культуры или для одновременного выделения плазмидной ДНК из большого числа культур малого объема («miniprep»).

Почти всегда для выделения плазмид используют культуры, растущие в содержащей соответствующий антибиотик жидкой среде и полученные наращиванием одной снятой с агара бактериальной колонии. Если плазмидные векторы (например, pUC) реплицируются в клетке с образованием большого числа копий, то соответствующие плазмиды можно получить в больших количествах из культур, выращенных в стандартной LB-среде до достижения поздней логарифмической фазы (примерно 18 ч).

Однако если используемый вектор реплицируется не столь бесконтрольно (как, например, плазмида pBR322), его приходится селективно амплифицировать инкубацией бактериальной культуры в течение нескольких часов в среде с хлорамфениколом (170 мкг/мл). Хлорамфеникол ингибирует синтез белков клетки-хозяина и тем самым нарушает репликацию бактериальной хромосомы. При этом репликация плазмид продолжается еще в течение нескольких часов, что позволяет значительно увеличить выход плазмидной ДНК по сравнению с неамплифицированными культурами.

очистка плазмидной днк

Основные методы очистки плазмидной ДНК

Большинство методов вьщеления плазмид основаны на том, что последние имеют ковалентно замкнутую кольцевую форму (ССС) и гораздо меньшие размеры, чем бактериальная хромосома. Бактериальные клетки собирают центрифугированием и лидируют, обычно с помощью ЭДТА и лизоцима, разрушающего клеточную стенку. Можно также использовать органические растворители, нагревание, неионные детергенты. Фрагменты клеток и бактериальной хромосомы после лизиса удаляют центрифугированием.

Чаще всего при работе с культурами любого объема — как малого, так и большого — используется предложенный в работе щелочной метод вьщеления. В присутствии щелочи основная масса загрязняющих плазмидную ДНК фрагментов хромосомной ДНК, белков и РНК выпадает в осадок, так что получаемые препараты плазмидной ДНК оказываются достаточно чистыми для обработки рестриктирующими эндонуклеазами и последующего клонирования. Для дальнейшей очистки выделенной плазмидной ДНК можно провести центрифугирование в равновесном градиенте плотности в присутствии красителя.

В основе щелочного метода лежит то, что в щелочных условиях (при рН ~ 12) происходит денатурация только линейных молекул ДНК (т. е. разделение цепей двухцепочечной ДНК клетки-хозяина), плазмидные же ССС-молекулы не денатурируют. При нейтрализации клеточного экстракта в присутствии солей высокой концентрации денатурированная хромосомная ДНК выпадает в осадок, поскольку реассоциация длинных линейных одноцепочечных молекул ДНК происходит в этих условиях одновременно во множестве участков с образованием нерастворимых комплексов.

Клеточная РНК и белки тоже осаждаются вследствие того, что при осаждении используется детергент ДСН. В протоколе описан в деталях вариант этого метода для вьщеления небольших количеств плазмидной ДНК из Е. coli K12, а в протоколе — метод получения больших количеств более чистой плазмидной ДНК, включающий центрифугирование в равновесном градиенте плотности в присутствии красителя.

- Читать далее "Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры"

Оглавление темы "Выделение ДНК и РНК. Плазмиды":
1. Одновременное выделение ДНК и РНК. Техника одновременного выделения ДНК и РНК
2. Очистка poly(A)+-PHK. Выделение poly(A)+-PHK
3. Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле
4. Электрофорез РНК в формальдегидном геле. Количественный анализ нуклеиновых кислот
5. Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды
6. Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами
7. Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК
8. Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры
9. Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК
10. Мечение нуклеиновых кислот. Разновидности мечения нуклеиновых кислот

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: