Электрофорез РНК в формальдегидном геле. Количественный анализ нуклеиновых кислот

Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• Формальдегид: обычно его поставляют в виде 37% водного раствора. Формальдегид окисляется на воздухе, поэтому его необходимо хранить плотно закрытым. рН концентрированного раствора должен быть выше 4,0. Если рН становится ниже этого значения, формальдегид необходимо заменить
• Формамид: обычно формамид высокой степени чистоты можно использовать в том виде, в каком он поступает от фирмы. Однако если он имеет желтоватый цвет, его необходимо деионизовать с помощью смеси ионообменных смол, как это описано в протоколе.
• 10 х буфер для электрофореза: 0,2 М MOPS, 75 мМ ацетат натрия, 20 мМ ЭДТА, рН 7,0
• Буфер для нанесения: 50% глицерин, 0,25% бромфеноловый синий в 1 х буфере для электрофореза

Методика
1. Готовят 1,6% (в/о) агарозу на обработанной ДЭПК воде и охлаждают раствор до примерно 60 С.
2. Добавляют 1/7 объема 10 х буфера для электрофореза и 1/4 объема формальдегида (37% раствор), тщательно перемешивают. Конечная концентрация агарозы при этом равна примерно 1,1%.
3. Растворяют каждый образец РНК (содержащий примерно 20 мкг РНК) в 3,3 мкл воды и добавляют 1,5 мкл 10 х буфера для электрофореза, 7,5 мкл формамида и 2,7 мкл формальдегида.

электрофорез рнк

4. Денатурируют РНК в течение 15 мин при 65 С и охлаждают ее во льду в течение 5 мин.
5. Добавляют к каждому образцу по 2,5 мкл буфера для нанесения, перемешивают и быстро центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g.
6. Вносят образцы в лунки агарозного геля и проводят электрофорез при градиенте напряженности 1—3 В/см в 1 х буфере для электрофореза. Через 1-2 ч после начала электрофореза буфер заменяют
7. По окончании электрофореза (когда бромфеноловый синий дойдет до конца геля) окрашивают гель в водном растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) при аккуратном покачивании в течение I ч. При сильном фоновом окрашивании лишний бромистый этидий отмывают водой (две смены по 30 мин каждая).

8. Просматривают гель на УФ-трансиллюминаторе и фотографируют его фотоаппаратом «Поляроид».
- Бромистый этидий (1 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл) можно добавить непосредственно в образцы РНК еще до электрофореза.
- Во время электрофореза в геле, содержащем формальдегид, фрагменты ДНК обычно деградируют. Кроме того, при проведении электрофоре:» в таких условиях молекулы РНК движутся быстрее, чем молекулы ДНК такого же размера. По этим причинам в качестве маркера необходимо использовать РНК, а не ДНК

Количественный анализ нуклеиновых кислот

Для определения концентрации ДНК и РНК в растворе широко используются два метода. Наиболее простым и точным является спектрофотометрический метод, однако он обладает сравнительно малой чувствительностью. Если общее содержание нуклеиновых кислот невелико, то концентрацию ДНК и РНК можно определить по интенсивности их флуоресценции в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.

а. Электрофоретический метод
Для примерной оценки концентрации препаратов ДНК или РНК на гель наносят разные количества маркерных нуклеиновых кислот. Концентрацию исследуемых ДНК или РНК в образце оценивают, сравнивая интенсивность флуоресценции образца и стандартных маркеров с известной концентрацией. При этом важно, чтобы образцы ДНК и РНК сравнивались с соответствующими маркерами, поскольку при одинаковом количестве ДНК и РНК интенсивность их флуоресценции в УФ-свете различается.

б. Метод пятен
Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно определить, окрасив раствор бромистым этидием, измерив интенсивность флуоресценции в УФ-свете и сравнив ее с флуоресценцией маркеров известной концентрации. Как и при электрофоретическом методе, маркеры должны представлять собой нуклеиновые кислоты соответствующего типа (т. е. ДНК или РНК). Этот метод описан в протоколе.

- Читать далее "Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды"

Оглавление темы "Выделение ДНК и РНК. Плазмиды":
1. Одновременное выделение ДНК и РНК. Техника одновременного выделения ДНК и РНК
2. Очистка poly(A)+-PHK. Выделение poly(A)+-PHK
3. Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле
4. Электрофорез РНК в формальдегидном геле. Количественный анализ нуклеиновых кислот
5. Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды
6. Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами
7. Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК
8. Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры
9. Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК
10. Мечение нуклеиновых кислот. Разновидности мечения нуклеиновых кислот

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: