Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами

В основе большиства методов трансформации бактерий лежат данные о том, что обработка бактерий на холоду раствором хлористого кальция и последующее кратковременное нагревание индуцируют у них временное состояние «компетентности», когда они могут поглошать из раствора чужеродную ДНК.

Компетентные клетки Е. coli можно либо приобрести у коммерческих фирм (BRL, Gaithersburg, Maryland, USA), либо получить в лаборатории и использовать их немедленно или заморозить. Коммерческие препараты компетентных клеток обладают высоким качеством и позволяют получить частоту трансформации более 108 колоний на 1 мкг сверхспиральной плазмидной ДНК. Однако эти препараты очень дороги.

В протоколе описан метод получения компетентных бактериальных клеток, обеспечивающий частоту трансформации ~107 трансформированных колоний на 1 мкг плазмидной ДНК. Он идеально подходит для таких бактериальных штаммов, как JM109, НВ101, TG1 и TG2, но с его помощью можно трансформировать примерно с такой же частотой практически любой бактериальный штамм. Такая эффективность трансформации достаточно высока для осуществления всех рутинных операций клонирования в плаз-мидах, однако, например, для получения плазмидных библиотек кДНК, синтезированных на редких мРНК, нужна более высокая частота трансформации и необходимы альтернативные методы.

Метод, описанный в работе, позволяет получать компетентные культуры клеток Е. coli штаммов DH1, DH5 и ММ294, для которых частота трансформации достигает 7,5 • 108 колоний на 1 мкг сверхспиральной плазмидной ДНК. Более высокую частоту (109—1010) можно получить только с помощью электропорации. Этот метод разрабатывался для введения ДНК в клетки эукариот, но недавно его использовали и для трансформации Е. colt. Необходимые для электропорации специальный высоковольтный мини-электрод и кювета для образца вместе с детальным описанием процедуры трансформации поставляются фирмой Bio-Rad. Успешное получение компетентных клеток с помощью описанного в протоколе метода зависит от нескольких факторов. Особое внимание следует обратить на:

а) плотность культуры бактериальных клеток;
б) поддержание во время всех процедур температуры на уровне 0-4 С.
Получение компетентных клеток Е. coli обработкой хлористым кальцием

компенентные клетки

Материалы
• 0,1 М СаС12
• Диметилсульфоксид (ДМСО)
• Среда LB: 10 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl растворяют в 1 л деионизованной воды и доводят рН до 7,0 с помощью 5 М NaOH. Стерилизуют автоклавированием в жидком цикле.
• Для получения LB-arapa на 1 л среды добавляют 15 г агара Difco и стерилизуют автоклавированием, как описано выше.
• Среда SOB: 20 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г NaCl растворяют в 950 мл деионизованной воды, добавляют 10 мл 250 мМ НС1, доводят рН до 7,0 с помощью 5 М NaOH и доводят объем до 1 л. Стерилизуют, как описано выше.
• Среда SOC: идентична среде SOB за исключением того, что содержит также 20 мМ глюкозу. После автоклавирования среды SOB ее охлаждают и добавляют 20 мл 1 М стерилизованной фильтрацией глюкозы.

Методика
1. Снимают одиночную бактериальную колонию с чашки с LB-агаром, инкубированной при 37 'С в течение 16—20 ч, и переносят ее в 10 мл LB-среды в пробирке на 20 мл. Инкубируют при 37 °С и сильной аэрации (200 об/мин на круговом шейкере) в течение ночи.
2. 1 мл полученной ночной культуры вносят в 100 мл среды LB, налитой в колбу на 1 л, и инкубируют ее при 37 °С и сильной аэрации (200 об/мин на круговом шейкере) в течение примерно 2 ч до достижения плотности ~108 клетка/мл (ОД600 ~ 0,4).
3. Переносят культуру в стерильные охлажденные центрифужные пробирки на 50 мл (Falcon 2070) и охлаждают до 0 С инкубацией во льду в течение 10 мин.
4. Собирают клетки центрифугированием (ротор Sorvall GS3 или аналогичный) при 4300 g в течение 5 мин при 4 С.

5. Сливают надосадок и переворачивают пробирку на 1 мин для полного его стекания.
6. Ресуспендируют клеточный осадок в 10 мл ледяного 0,1 М СаСl2 при осторожном встряхивании и инкубируют клетки во льду в течение 30 мин.
7. Собирают клетки центрифугированием (ротор GS3 или аналогичный) при 4300 g в течение 5 мин при 4 С.
8. Сливают супернатант и переворачивают пробирку на 1 мин, с тем чтобы супернатант полностью стек.
9. Ресуспендируют каждый осадок в ледяном 0,1 М СаСl2(из расчета 2 мл на 50 мл исходного объема культуры). До использования суспензию лучше оставить на 1 ч при 4 С; при 4 °С ее можно хранить до 48 ч (но после 24 ч хранения эффективность трансформации будет снижаться). Суспензию можно разлить на аликвоты и хранить при -70 С.
10. С помощью охлажденного стерильного наконечника для микропипетки переносят по 200 мл каждой суспензии в стерильную полипропиленовую пробирку (Falcon 2059 17 х 100 мм). Добавляют сверхспиральную плазмидную ДНК (не более 50 нг в объеме не более 10 мкл), осторожно перемешивают и 30 мин инкубируют во льду.

Контроли
• Компетентные клетки, к которым добавлено известное количество (от 1 до 20 нг) сверхспиральной плазмидной ДНК.
• Компетентные клетки, к которым плазмидная ДНК не добавлялась.
11. Переносят пробирки ровно на 90 с в водяную баню на 42 °С, Пробирки при этом не встряхивают.
12. Быстро переносят пробирки обратно в лед и инкубируют 2 мин.

13. Добавляют в каждую пробирку 800 мкл среды SOC и для индукции экспрессии кодируемого плазмидой маркера устойчивости к антибиотикам инкубируют их при умеренной аэрации (100 об/мин) в течение 45 мин при 37 С.
14. Переносят до 200 мкл трансформированных компетентных клеток в содержащие соответствующий антибиотик чашки Петри диаметром 90 мм с LB- или SOB-средой. Равномерно распределяют трансформированные клетки по поверхности агара стерильной изогнутой стеклянной палочкой.
15. Оставляют чашки при комнатной температуре до подсыхания.
16. Переворачивают чашки и инкубируют их при 37 С. Колонии становятся видимыми через 12-16 ч.

- Добавляют к 2 мл ресуспендированных клеток 70 мкл ДМСО, аккуратно перемешивают и помещают суспензию на 15 мин в лед.
- Добавляют к каждой суспензии еще 70 мкл ДМСО, опять аккуратно перемешивают и помещают суспензию в лед.
- Быстро разливают суспензию порциями по 50 мкл в охлажденные стерильные микроцентрифужные пробирки и замораживают компетентные клетки в жидком азоте. До использования хранят пробирки при - 70 С.
- При необходимости суспензию размораживают, подержав пробирку в руках, и помещают в лед как минимум на 10 мин.

- Читать далее "Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК"

Оглавление темы "Выделение ДНК и РНК. Плазмиды":
1. Одновременное выделение ДНК и РНК. Техника одновременного выделения ДНК и РНК
2. Очистка poly(A)+-PHK. Выделение poly(A)+-PHK
3. Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле
4. Электрофорез РНК в формальдегидном геле. Количественный анализ нуклеиновых кислот
5. Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды
6. Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами
7. Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК
8. Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры
9. Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК
10. Мечение нуклеиновых кислот. Разновидности мечения нуклеиновых кислот

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: