Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры

В присутствии бромистого этидия различие в плавучей плотности плазмидной и хромосомной ДНК становится еще более значительным. Связываясь с линейной двухцепочечной ДНК, этот краситель встраивается между плоскостями оснований (интеркалирует), вызывает расплетание двойной спирали, увеличивает длину линейных фрагментов хромосомной ДНК и приводит к снижению ее плавучей плотности. В плазмидной ССС-ДНК интеркаляция красителя вызывает образование компенсаторных сверхспиральных витков, и при достаточно большом их числе встраивание следующих молекул бромистого этидия становится невозможным.

При равновесном центрифугировании в градиенте насыщенного раствора хлористого цезия в присутствии бромистого этидия плазмидная ДНК имеет более высокую плавучую плотность, чем хромосомная, и концентрируется в полосе, расположенной ниже, чем полоса хромосомной ДНК. Обычно эта полоса имеет красный цвет и ее не нужно визуализировать в УФ-свете. РНК при центрифугировании осаждается на дне пробирки.

Чтобы отобрать плазмидную ДНК после центрифугирования, пробирку прокалывают сбоку на нужной высоте иглой, надетой на шприц, и отсасывают материал. Обычно препарат плазмидной ДНК после центрифугирования в равновесном градиенте плотности в присутствии красителя содержит очень мало РНК и белков и они не влияют на последующие манипуляции с плазмидной ДНК. При необходимости примеси белков можно удалить экстракцией фенолом/хлороформом, а примеси РНК — центрифугированием или хроматографией. Если провести ультрацентрифугирование не удается, то процедуру вьщеления из больших объемов культуры можно довести до п. 8, а потом до переосаждения этанолом удалить белковые примеси, как это описано в протоколе.

Выделение плазмидной ДНК из небольшого объема бактериальной культуры

Материалы
• Раствор I: 50 мМ глюкоза, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА. Хранить при 4 °С
• Раствор II: 0,2 М NaOH, 1,0% (о/о) ДСН. Раствор можно хранить при комнатной температуре не более недели.
• Раствор III: 60 мл 5 М ацетата аммония, 11,5 мл ледяной уксусной кислоты, 28,5 мл Н20. Полученный в результате раствор является 3 М по ионам аммония и 5 М по ацетат-ионам.
• Раствор IV: 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5.

плазмидная ДНК

Методика
1. Одну бактериальную колонию (полученную в результате эксперимента по трансформации, как это описано в протоколе 13.1, или ранее расштрихованную из хранящейся в глицерине бактериальной культуры) вносят в неплотно закрытую пробирку на 15 мл с 2 мл LB-среды, содержащей соответствующий антибиотик. Растят бактериальную культуру при интенсивном встряхивании (200 об/мин) при 37 С в течение ночи до ОД600=1Д
2. Переносят 1,5 мл культуры в микроцентрифужную пробирку и собирают клетки центрифугированием при 12 000 g в течение 1 мин. Оставшуюся культуру хранят при 4 С.
3. Отсасывают супернатант и при интенсивном встряхивании ресуспендируют осадок бактериальных клеток в 100 мкл холодного раствора I. Инкубируют во льду 15 мин.

4. Добавляют 200 мкл раствора II и перемешивают смесь быстрым пятикратным переворачиванием закрытой пробирки без встряхивания. Инкубируют пробирку во льду 5 мин.
5. Добавляют 150 мкл буфера 111, закрывают пробирку и перемешивают содержимое осторожным встряхиванием в течение 10 с. Инкубируют во льду 10 мин.
6. Центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 мин при 4 С и отбирают супернатант в новую пробирку.

7. Для осаждения двухцепочечной ДНК добавляют 1 мл холодного этанола, перемешивают встряхиванием и на 30 мин помещают на —20 С.
8. Центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 мин при 4 С.
9. Осторожно отбирают супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл раствора IV.
10. Добавляют 200 мкл этанола, перемешивают и на 10 мин помещают на —20 °С. Центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 2 мин при 4 °С.

11. Отбирают супернатант, добавляют к осадку 1 мл этанола, центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 2 мин при 4°С.
12. Отбирают супернатант, осадок нуклеиновых кислот подсушивают на воздухе в течение 10 мин. Растворяют нуклеиновые кислоты в 50 мкл ТЭ и хранят при -20 С.
Обычно метод, описанный в протоколе, дает при выделении многокопийных плазмид типа pUC выход 3-5 мкг ДНК на 1 мл исходной бактериальной культуры. Если полученные таким способом мини-препараты ДНК не удается рестрицировать, то для удаления загрязнений можно провести экстракцию фенолом/хлороформом. Пропорционально увеличив количество всех необходимых реактивов, можно использовать данный метод для выделения ДНК из культур объемом до 10 мл.

- Читать далее "Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК"

Оглавление темы "Выделение ДНК и РНК. Плазмиды":
1. Одновременное выделение ДНК и РНК. Техника одновременного выделения ДНК и РНК
2. Очистка poly(A)+-PHK. Выделение poly(A)+-PHK
3. Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле
4. Электрофорез РНК в формальдегидном геле. Количественный анализ нуклеиновых кислот
5. Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды
6. Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами
7. Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК
8. Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры
9. Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК
10. Мечение нуклеиновых кислот. Разновидности мечения нуклеиновых кислот

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: