Эти протоколы предназначены для одновременного выявления разных подтипов вируса папилломы (HPV) в мазках шейки матки с помощью ДНК-зондов, меченных биотином и дигоксигенином.

А. Одноэтапная детекция
1. Проводят операции.
2. На каждые 600 мкл ТБТ, содержащего 5% (в/о) обезжиренное молоко, добавляют 1 мкл авидина, конъюгированного с пер-оксидазой (Dako, UK), и 6 мкл щелочной фосфатазы, конъю-гированной с антителами к дигоксигенину (Boehringer Mannheim); инкубируют препараты в этом растворе при комнатной температуре в течение 30 мин.
3. Промывают в ТСБ дважды по 5 мин.
4. Проявляют биотин (красная метка), инкубируя препарат с субстратом АЭК/Н2О2 при комнатной температуре в течение 15-30 мин, и промывают препараты в двух сменах ТСБ, по 5 мин в каждой.
5. Проявляют дигоксигенин (темно-синий цвет), инкубируя препарат с субстратом нитросиний тетразолий/5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (см, протокол 4.7) при комнатной температуре в течение 30—60 мин.
6. Промывают препараты в дистиллированной воде и заключают в водорастворимую среду, например в глицерин с желатиной.

Б. Детекция с амплификацией
1. Проводят операции.
2. Инкубируют препараты с моноклональными антителами к биотину, разведенными в ТБТ в отношении 1:50, в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Инкубируют препараты с биотинилированными кроличьими антителами к иммуноглобулину мыши (фрагмент F(ab)2], разведенными в ТБТ в отношении 1:200, в течение 30 мин при комнатной температуре.
4. Проводят операции.

Контроли гибридизации цитопрепаратов

Чтобы быть уверенным в специфичности регистрируемого сигнала, каждый эксперимент следует сопровождать контролем. Однако при анализе цитологических препаратов, в частности мазков шейки матки, возникают особые проблемы. Так, если исследуется материал, заключенный в парафин, то для контроля можно использовать серийные срезы. В то же время цитологические препараты, приготовленные из одной и той же ткани, содержат разные клетки-мишени. Это следует иметь в виду, ставя контрольные опыты при работе с мазками. В случае мазков шейки матки ситуация осложняется тем, что обычно берут только один мазок. При исследовании цитологических препаратов ставят два типа контролей: параллельный и внутренний.

Параллельный контроль. Речь идет об использовании для гибридизации заведомо положительного контрольного зонда. Так, можно провести гибридизацию клеток CaSki с НРУ16-зондом или гибридизацию репрезентативного мазка шейки матки с зондом для ДНК человека. Этот контрольный эксперимент позволяет убедиться в том, что в техническом отношении все процедуры выполнены правильно, однако он ничего не говорит о специфичности зонда,

Внутренний контроль. Чтобы убедиться в специфичности гибридизации и исключить получение ложноотрицательных результатов при ограниченном количестве цитологического материала, необходимо провести одновременную или последовательную двойную гибридизацию с использованием контрольного и тест-зондов. Это аналогично одновременной амплификации конститутивных геномных последовательностей, например амплификации гена р-глобина и другой, интересующей нас последовательности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выявления ДНК HPV в мазках шейки матки можно использовать два подхода: одновременную гибридизацию с какой-нибудь геномной последовательностью и с HPV-зондом с последующей детекцией одним из способов, описанных в протоколе, либо последовательную гибридизацию с ДНК НРV кожи и с ДНК HPV интересующего настипа, например HPV 6, 11 и т. д. Контроль с одновременной гибридизацией позволяет судить об адекватности образца и имеет то преимущество перед использованием разных мазков и гибридизацией с суммарной геномной ДНК, что позволяет судить о доступности нуклеиновых кислот мазка для зонда. Оптимальными зондами для внутреннего контроля являются некодирующие высокоповторяющиеся последовательности, например альфоидная ДНК. Для контроля неспецифической гибридизации с вектором и подбора уровня жесткости условий гибридизации используют последовательности кожных типов HPV, клонированные в том же векторе, что и последовательности аногенитальных типов вируса. При последовательной гибридизации мазков шейки матки с ДНК HPV 2, а затем со смесью ДНК HPV6, 11, 16, 18 и 33 в такой же суммарной концентрации сигнал был получен только для смеси зондов при проведении процедуры по протоколу.

- Читать далее "Результаты гибридизации цитопрепаратов. Специфичность гибридизации цитопрепаратов"