Однако при работе с цитологическими препаратами возникают свои трудности, которые мы здесь обсудим. В мазках шейки матки присутствует внеклеточный муцин, на который осаждается субстрат. Это может привести к сильному фоновому окрашиванию вследствие как неспецифического связывания зонда, так и неферментативных изменений субстрата. Для уменьшения фона мы использовали несколько разных способов и обнаружили, что хороший эффект дает добавление в гибридизационную смесь макромолекул. Впрочем, фон не исчезает полностью, и приходится принимать дополнительные меры. Приготовление гибридизационной смеси детально описано в протоколе. Предгибридизационная инкубация препаратов в этой смеси в отсутствие ДНК-зонда неэффективна. При выявлении ДНК тепловую денатурацию зонда и мишени рекомендуется проводить одновременно, и лучше это делать, нанеся зонд непосредственно на препарат, как это описано в протоколе.

Для гибридизации in situ с двумя зондами зонды, меченные разными молекулами-свидетелями, можно смешать и денатурировать одновременно. На каждый препарат необходимо наносить столько гибридизационной смеси, чтобы не допустить подсыхания во время денатурации и гибридизации. Как показывает наш опыт, если денатурацию проводят при температуре ниже 100 С, а гибридизацию — при температуре 42 °С в течение 2-16 ч, то для обычных мазков шейки матки достаточно 50 мкл гибридизационной смеси. Точный объем следует подбирать экспериментально, и если подсыхание все-таки происходит, препараты следует накрыть покровными стеклами и промазать по краям резиновым клеем.

Дополнительные компоненты, необходимые для гибридизации случае мазков шейки матки
- Пирофосфат натрия
- Поливинилпирролилон (мол. масса 40 000)
- Фиколл (мол. масса 400 000)
- ДНК человека (для вирусных последовательностей) в количестве, превышающем в 100-1000 раз количество зонда
- ДНК, спермы лосося или сельди (дли геномных последовательностей человека) в количестве, превышающем в 100-1000 раз количество зонда

Денатурация и гибридизация цитопрепаратов

Для обнаружения вирусных последовательностей нужна фрагментированная ДНК человека, а для выявления ДНК человека — фрагментированная ДНК спермы сельди или лосося.

Материалы
• Гибридизационная смесь
• Буфер ТЭ-ППФ: 500 мМ трис-HCi, рН 8,0, содержащий 50 мМ ЭДТА, 1% (в/о) пирофосфат натрия, 2% (в/о) поливинилпирролидон (мол. масса 40 000), 2% фиколл (мол. масса 400 000). Для растворения компонентов нагревают эту смесь до 65 С, после растворения инкубируют при этой температуре 15 мин. Буфер можно хранить при комнатной температуре
• ДНК человека (для вирусных последовательностей): выделяют ДНК из лимфоцитов периферической крови и растворяют в воде до концентрации 10 мг/мл. Фрагментируют ДНК в течение 20 мин в автоклаве
• ДНК спермы сельди (для геномных последовательностей): растворяют ДНК в воде до концентрации 10 мг/мл и фрагментируют, как описано выше

Методика
l. Ha каждые 35 мкл гибридизационного буфера добавляют по 1 мкл ДНК спермы сельди и зондов. В наших опытах конечная концентрация зондов составляет 1—2 мкл/мл, но, вообще говоря, концентрацию следует подбирать опытным путем. Зонды можно добавлять по отдельности или все вместе; они могут быть помечены молекулами-свидетелями одного или нескольких типов.
2. Добавляют буфер ТЭ-ППФ до конечного объема 50 мкл и непродолжительное время перемешивают на встряхивателе.
3. Наносят полученную смесь на мазки, приготовленные так, как это описано в протоколах 9.1 и 9.2, и накрывают подходящими по размеру покровными стеклами. Для клеточных суспензий мы используем предметные стекла с четырьмя ячейками (Hendley, Essex), внося в каждую ячейку примерно 5,5 мкл гибридизационной смеси, и круглые покровные стекла диаметром 14 мм. В случае обычных мазков шейки матки наносят по 50 мкл на препарат и накрывают покровным стеклом 22 х 50 мм.
4. Помещают по два предметных стекла в каждую микротитровальную плашку (Gibco, UK) с небольшим количеством воды во избежание подсыхания препаратов и проводят денатурацию при 95 °С в течение 15 мин в сухом термостате. Денатурацию препаратов, фиксированных только с помощью МУК, проводят при 75 С в течение 6-7 мин.
5. Переносят препараты в термостат на 42 С и инкубируют 2 ч.
- Зонды, меченные разными молекулами-свидетелями, можно смешивать и денатурировать или гибридизовать вместе.
- Препараты, фиксированные только с помощью МУК, следует денатурировать при более низкой температуре. Нагревание до 95 С приводит к лизису.

- Читать далее "Отмывание цитопрепаратов. Детекция гибридизовавшегося зонда цитопрепаратов"