Отмывание после неизотопной гибридизации. Обнаружение специфических мРНК

Отмывание препарата после гибридизации в условиях повышенной жесткости приводит к диссоциации несовершенных гибридов, и в идеале после этой процедуры зонд должен быть связан только с комплементарными последовательностями нуклеиновой кислоты-мишени. Если гибридизация проводится в мягких условиях, способствующих неспецифическому связыванию зонда, то отмывание следует проводить в жестких условиях, и в большинстве из описанных протоколов используется именно этот подход. При проведении же самой гибридизации в достаточно жестких условиях отмывание при повышенной жесткости не обязательно. По нашим данным, длительное отмывание препаратов в 2 х SSC (1 ч при 20 °С) с последующим отмыванием в жестких условиях (0,2 х SSC в 50% формамиде при 50 С в течение 30 мин) не приводит к снижению фона по сравнению с отмыванием в 2 х SSC дважды по 5 мин при комнатной температуре.

РНК-зонды особенно склонны к неспецифическому связыванию. Возникающий при этом фон можно сушественно снизить обработкой РНКазой, специфически расщепляющей негибридизовавшуюся одноцепочечную РНК, но не гибриды РНК—РНК.

Для визуализации неизотопно меченных зондов применяют несколько систем детекции. Мы предпочитаем использовать для работы с меченными биотином и дигоксигенином зондами два из них. Более чувствителен непрямой метод с использованием трех антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой—НСТ/БХИФ, но он — особенно в случае биотинилированных зондов —дает более высокий фон. Тем не менее мы рекомендуем сначала попробовать этот метод и только затем для снижения фона прибегать к менее чувствительному прямому (одно антитело) методу. Кроме того, можно заменить НСТ/БХИФ на краситель быстрый красный, который, впрочем, обеспечивает меньшую чувствительность.

Обнаружение специфических мРНК при помощи неизотопной гибридизации in situ

Материалы
• Обработанная ДЭПК ультрачистая или билистиллированная вода
• Раствор пепсин-НС1: 0,1 г пепсина (Р7000, Sigma) растворяют в 96 мл нагретой до 37 С воды и добавляют 4 мл 5 М НС1 до конечной концентрации 0,2 М
• ФСБ
• Свежеприготовленный 4% параформальдегид
• Глицин

неизотопная гибридизация

• Протеиназа К (Boehringer Mannheim)
• Раствор РНКазы А: 150 мкг/мл свободной от ДНКаз РНКазы А (Boehringer Mannheim) в 2 х SSC
• Раствор ДНКазы I: 200 мкг/мл свободной от РНКаз ДНКазы (Boehringer Mannheim) в 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2
• 20 х SSC: 3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0
• Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА

• Гибридизационный буфер (ГБ): 5 мл деионизованного фор-мамида, 1 мл 50% декстрансульфата, 1 мл 20 х SSC (более подробно приготовление буфера описано в гл. 4)
• Гибридизационная смесь (ГС): 7 мкл БГ, 2 мкл буфера ТЭ, 1 мкл меченого зонда (рибо- или олиго-) в соответствующем разведении1'
• Трис-солевой буфер (ТСБ): 50 мМ трис-HCl, рН 7,2, 100 мМ NaCl
• Блокирующий раствор (ТБТ): ТСБ, содержащий 3% (в/о) БСА, 0,05% (о/о) тритон Х-100
• Моноклональные антитела к дигоксигенину (Sigma, UK)

• Биотинилированные кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыши (фрагмент F(ab)) (например, Dakopatts, UK)
• Конъюгированная со стрептавидином щелочная фосфатаза (например, Dakopatts, BK)
• Сухое обезжиренное молоко (например, Marvel, Cadburys)
• Субстрат НСТ/БХИФ

Методика

А. Депарафинирование (только для срезов залитых в парафин тканей)
1. Парафин расплавляют, прогревая срезы в течение 10 мин при 75 С.
2. Еще теплые срезы переносят в ксилол и промывают 2 раза по 5 мин.
3. Дважды по 5 мин промывают в метаноле.
4. Дважды быстро промывают срезы в обработанной ДЭПК воде и переходят к демаскированию.

Б. Демаскирование РНК
1. (а) Фиксированные формалином срезы инкубируют 20 мин в водяной бане при 37 С в сосуде Коплина в 0,1% пепсине-НСl. (б) В случае свежефиксированных параформальдегидом препаратов нуклеиновые кислоты демаскируют обработкой в течение 15 мин при 37 С протеиназой К (1 мкг/мл).
2. Дважды быстро промывают срезы в обработанной ДЭПК воде.
3. Проводят дополнительную фиксацию срезов в 4% (в/о) парафор-мальдегиде в ФСБ в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Промывают срезы в 0,2% (в/о) глицине в ФСБ в течение 5 мин.
5. Используемые в качестве контроля препараты инкубируют с РНКазой или ДНКазой I в течение 30 мин при 37 °С.
6. Быстро ополаскивают срезы в ФСБ, обработанной ДЭПК воде и метаноле.
7. Высушивают срезы при 37 °С.

В. Гибридизация
1. Наносят на срез необходимое количество гибридизационной смеси2'. Срез накрывают покровным стеклом так, чтобы под стекло не попали пузырьки воздуха.
2. Прогревают срезы во влажной чашке Терасаки при 95 С в течение 15 мин.
3. Проводят гибридизацию в выбранных (температура и время) условиях.

Г. Отмывание после гибридизации
1. Чтобы снять покровное стекло и удалить несвязавшийся зонд, промывают срез в течение 5 мин в 2 х SSC.
2. Если используются рибо-зонды, обрабатывают срезы в течение 30 мин при 37 С РНКазой А.
3. Промывают в двух сменах 2 х SSC, по 5 мин в каждой, при комнатной температуре.

Д. Детекция
1. Промывают срезы в течение 10 мин в блокирующем растворе.
2. Инкубируют в течение 30 мин во влажной камере с разведенными в ТБТ в соотношении 1:10 000 антителами к дигокси-генину.
3. Промывают в ТСБ,
4. Инкубируют в течение 20 мин с разведенным в ТБТ в соотношении 1:200 биотинилированным F(аb)'2-фрагментом кроличьих антител к иммуноглобулинам мыши.
5. Промывают в ТСБ.
6. Инкубируют в течение 20 мин в конъюгате стрептавидина с щелочной фосфатазой, разведенном в соотношении 1:50 ТБТ, содержащем 3% (в/о) сухое обезжиренное молоко.
7. Промывают в ТСБ.
8. В темноте в течение I ч инкубируют с НСТ/БХИФ (через каждые 10—15 мин проверяя под микроскопом, как изменяется сигнал).
9. Промывают срезы в течение 5 мин в проточной воде.
10. Высушивают срезы при температуре 37—75 С, окрашивают метиловым зеленым и монтируют с использованием глицеринового желе.

- Читать далее "Транскрипция in situ мРНК. Неизотопная транскрипция in situ мРНК"

Оглавление темы "Исследование цитопрепаратов":
1. Выбор неизотопной метки. Денатурация и гибридизация мРНК
2. Отмывание после неизотопной гибридизации. Обнаружение специфических мРНК
3. Транскрипция in situ мРНК. Неизотопная транскрипция in situ мРНК
4. Гибридизация in situ для диагностики цитопатологий. Получение материала и подготовка цитопрепаратов
5. Фиксация нуклеиновых кислот. Демаскирование нуклеиновых кислот
6. Денатурация цитопрепаратов. Гибридизация цитопрепаратов<
7. Отмывание цитопрепаратов. Детекция гибридизовавшегося зонда цитопрепаратов
8. Детекция двух разных зондов в цитопрепаратах. Контроли гибридизации цитопрепаратов
9. Результаты гибридизации цитопрепаратов. Специфичность гибридизации цитопрепаратов
10. Район ядрышкового организатора. Методы выявления ядрышкового организатора

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: