В последние годы в опытах по гибридизации in situ все чаще используются неизотопные метки, которые обеспечивают такую же чувствительность, как изотопные, но при этом более доступны, безопасны для персонала и окружающей среды, проще в работе. Неизотопными молекулами-свидетелями могут быть самые разные соединения. Очень широко (за исключением анализа тканей с высоким уровнем эндогенного биотина, например печени и почек) используется биотин, который связывается с высоким сродством с авидином и стрептавидином.

Часто предпочтение отдается растительному алкалоиду лигоксигенину, детектируемому при помоши моноклональных антител; он обеспечивает по крайней мере такую же чувствительность, как и биотин, при низком уровне неспецифического связывания и подходящих химических свойствах.

Обычно процедура ГИС включает стадию предгибридизации, цель которой состоит в снижении уровня неспецифического связывания зонда с клеточными структурами путем блокирования возможных мест связывания. Как нам представляется, предгиб-ридизацию имеет смысл проводить в случае неизотопной ГИС при анализе срезов залитых в парафин тканей, только когда в качестве зондов используются олигонуклеотиды, но не РНК (J. Burns, J.-С. Martinez-Montero, J. O'D. McGee, не опубликовано).

Предгибридизацию проводят в гибридизационной смеси, содержащей блокирующие вещества (РНК дрожжей, поливинилпирролидон, ДНК спермы лосося, тритон), но не содержащей зонда.

Может показаться, что денатурация нужна только при работе с двухцепочечными ДНК-зондами, и часто эта процедура действительно отсутствует в стандартных протоколах неизотопной ГИС с РНК-зондами. Однако наш опыт показывает, что одновременное прогревание в течение 15 мин при 95 С одноцепочечного рибозонда и тканевого среза существенно увеличивает чувствительность метода НГИС при выявлении мРНК лизоцима в архивных биоптатах желудка.

В результате такой обработки достаточно сильный сигнал появляется уже после непродолжительной (2 ч) гибридизации, тогда как без прогревания он становится заметен только при инкубации в течение ночи. Возможно, тепловая обработка повышает проницаемость клеточных структур и разрушает вторичную структуру мРНК и рибозонда.

Чтобы осуществить гибридизацию зонда с мРНК ткани, срезы под покровными стеклами инкубируют в течение 2-16 ч в смеси для гибридизации. В состав этой смеси входят зонд, используемые при предгибридизации блокирующие вещества, ингибиторы РНКаз, формамид и соли. Скорость отжига и термостабильность (Тт) дуплексов мРНК—зонд зависят от температуры гибридизации, концентрации солей и формамида, и при высокой температуре, большом содержании формамида и низкой концентрации солей в гибридизационной смеси (гибридизация в жестких условиях) образуются только высокогомологичные дуплексы.

Степень жесткости определяется требуемым уровнем гомологии между мРНК и зондом, типом и размером зонда, GC-содержанием в случае коротких зондов. Дуплексы РНК—РНК более стабильны, чем дуплексы, содержащие ДНК, поэтому гибридизацию с кРНК-зондами проводят при температуре, на 10—15 "С превышающей ту, при которой работают с ДНК-зондами.

Еще две изменяющиеся величины, важные для гибридизации, — размер зонда и его концентрация. Размер зонда, оптимальный для диффузии и проникновения в ткань, может в разных случаях различаться, но зонды размером более 1 т.н. можно гидролизовать щелочью. Мы считаем, что лучшие результаты при гибридизации получаются с полноразмерными (длиной примерно 600 нуклеотидов) транскриптами, а не с короткими, полученными при гидролизе фрагментами.

Оптимальной является такая концентрация зонда, при которой происходит насыщение всех сайтов связывания в мишени и достигается максимальное отношение сигнал/шум (фон возрастает пропорционально концентрации зонда). Для экономии зонда в гибридизационную смесь иногда добавляют полимер декстрансульфат, увеличивающий за счет эффекта исключенного объема эффективную концентрацию зонда.

- Читать далее "Отмывание после неизотопной гибридизации. Обнаружение специфических мРНК"