Фиксация нуклеиновых кислот. Демаскирование нуклеиновых кислот

Для неизотопной гибридизации in situ с одинаковым успехом можно использовать препараты, приготовленные любым из упомянутых выше способов. Процедура фиксации, применимая для всех этих препаратов, описана в протоколе. Для фиксации последовательно используют МУК и параформальдегид, поскольку
а) фиксация в МУК увеличивает клеточный объем и улучшает сохранность нуклеиновых кислот;
б) фиксация альдегидом повышает устойчивость клеток к нагреванию, способствует сохранности морфологии и позволяет проводить денатурацию при более высокой температуре;
в) альдегидная фиксация повышает чувствительность метода;
г) препараты перед гибридизацией подвергаются одинаковой обработке, что позволяет использовать стандартные процедуры гибридизации и детекции.

В некоторых случаях, например при работе с очищенными препаратами, в которых последовательность-мишень содержится в достаточно большом количестве, эти факторы несущественны, и достаточно фиксировать клетки в МУК в соответствии с протоколом. Дальнейшая предварительная обработка клеток необязательна и следует сразу же переходить к протоколу. Иногда (например, при гибридизации in situ с метафазными хромосомами) любая предобработка препаратов только ухудшает результаты.

Демаскирование нуклеиновых кислот

После фиксации клеток в альдегиде необходимо демаскировать нуклеиновые кислоты с помощью частичного протеолиза. Как показывает наш опыт, лучше всего использовать для этого протеиназу К в низкой концентрации, хотя вполне пригодны и другие ферменты, например пепсин. Протеолиз — очень важный этап, поэтому необходимо тщательно контролировать концентрацию ферментов и проверять активность каждой партии на контрольной системе.

Подготовленные таким образом препараты можно непосредственно использовать для гибридизации in situ, однако в некоторых случаях (в частности, при работе с мазками шейки матки, полученными рутинным способом) приходится проводить постфиксацию препаратов параформальдегидом, чтобы уменьшить потери клеточного материала.

Фиксация препаратов и демаскирование нуклеиновых кислот

Материалы
• Фосфатно-солевой буфер (ФСБ): 10 мМ фосфат, 150 мМ NaCl, рН 7,2
• ФСБ/глицин: 0,2% (в/о) глицин в ФСБ
• Метанол : уксусная кислота (3:1, о/о)
• 4% (в/о) параформальдегид: растворяют 4 г параформальдеги-да (BDH) в 100 мл ФСБ, нагрев его до кипения в конической колбе с отливной воронкой. Все работы проводят в вытяжном шкафу. Охлаждают раствор во льду
• Блокирующий раствор азид натрия/пероксид водорода: 0,1% (в/о) азид натрия, 0,3% (о/о) пероксид водорода в дистиллированной воде. Этот раствор следует готовить в вытяжном шкафу и работать в перчатках. Азид натрия высокотоксичен, поэтому все манипуляции с ним нужно проводить очень осторожно. 0,3% пероксид водорода готовят разбавлением водой имеющегося в продаже 30% раствора в отношении 1:100
• Протеиназа К (Boehringer Mannheim): 1 мкг/мл в ФСБ

фиксация нуклеиновых кислот

Методика
A. Фиксация
Этот метод пригоден для мазков, фиксированных в этаноле с уксусной кислотой или без нее или высушенных на воздухе, а также для препаратов, полученных центрифугированием, или способом, описанным в протоколе. Инкубацию проводят в химических стаканах,
1. На 10 мин погружают стекла в метанол/уксусную кислоту при комнатной температуре.
2. Переносят стекла в охлажденный параформальдегид и инкубируют 15 мин при комнатной температуре.
3. Инкубируют в растворе ФСБ/глицин, а затем в ФСБ, по 5 мин в каждом растворе.
4. Фиксированные таким образом препараты можно использовать сразу же или хранить при комнатной температуре.

Б. Блокирование эндогенной пероксидазы
1. Инкубируют стекла в блокирующем растворе азида натрия с пероксидом водорода в течение 20 мин при комнатной температуре.
2. Промывают стекла в ФСБ в течение 5 мин.

B. Демаскирование нуклеиновых кислот
Как показывает наш опыт, лучшие результаты дает использование протеиназы К. Другие ферменты описаны в гл. 4; возможность их применения для протеолиза в данной ситуации определяют опытным путем.
1. Прогревают раствор протеиназы К до 37 С.
2. Используют свежефиксированные препараты или препараты, промытые после хранения в ФСБ.
3. Погружают стекла в раствор протеиназы К и инкубируют 15 мин при 37 С.
4. Промывают препараты в свежеприготовленном ФСБ, затем 5 мин фиксируют в 4% параформальдегиде при комнатной температуре.
5. Промывают препараты в растворе ФСБ/глицин, приготовленном в соответствии с протоколом, затем в ФСБ, по 5 мин в каждом растворе.
6. Высушивают на воздухе при 75 С.

- Перед анализом мазков шейки матки, окрашенных ПАП, выдерживают стекла в ксилоле при 42 °С в течение ночи, удаляют покровные стекла, промывают препараты свежим ксилолом, проводят через батарею спиртов и промывают водой. Высушенные на воздухе мазки фиксируют в МУК.
- На этом этапе фиксируют ранее нефиксированные мазки, удаляют полиэтиленгликоль из препаратов, окрашенных карбоваксом, содержащим фиксаторы, и обесцвечивают мазки, окрашенные с помощью ПАП.
- Промывание препаратов в ФСБ уменьшает фон.

- Читать далее "Денатурация цитопрепаратов. Гибридизация цитопрепаратов"

Оглавление темы "Исследование цитопрепаратов":
1. Выбор неизотопной метки. Денатурация и гибридизация мРНК
2. Отмывание после неизотопной гибридизации. Обнаружение специфических мРНК
3. Транскрипция in situ мРНК. Неизотопная транскрипция in situ мРНК
4. Гибридизация in situ для диагностики цитопатологий. Получение материала и подготовка цитопрепаратов
5. Фиксация нуклеиновых кислот. Демаскирование нуклеиновых кислот
6. Денатурация цитопрепаратов. Гибридизация цитопрепаратов<
7. Отмывание цитопрепаратов. Детекция гибридизовавшегося зонда цитопрепаратов
8. Детекция двух разных зондов в цитопрепаратах. Контроли гибридизации цитопрепаратов
9. Результаты гибридизации цитопрепаратов. Специфичность гибридизации цитопрепаратов
10. Район ядрышкового организатора. Методы выявления ядрышкового организатора

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: