Макрорестрикционные карты. Контиг. Генетические карты и методы их построения.

Макрорестрикционные карты — дают информацию о взаиморасположении сайтов рестрикции редкощепящих рестриктаз и расстоянии между этими сайгами. Такие карты получают в результате последовательного разрезания ДНК отдельной хромосомы различающимися по сайту узнавания рестриктазами и упорядочения получаемых фрагментов после обработки каждой рестриктазой (собственно физического картирования). При одномоментном использовании нескольких рестриктаз получают фрагменты ДНК, соответствующие по длине расстоянию от концов молекулы ДНК до сайтов рестрикции, и фрагменты, размер которых соответствует расстоянию между сайтами рестрикции.

В любом случае для физического картирования исходной молекулы ДНК необходимо знать расположение одного из использованных ПДРФ-сайтов независимо от количества локализованных в этой молекуле сайтов рестрикции. Мечение рестрикционных фрагментов позволяет автоматизировать процесс.

Преимущество этого метода состоит в возможности получения полных, без пробелов, карт достаточно больших участков хромосомы. Разрешающая способность такой карты варьирует от 0,1 Мб до 1 Мб, что однако ниже чем у карт контиг.

контиг

Контиг — это набор упорядоченных перекрывающихся клонов ДНК, охватывающих всю хромосому ил и какой-либо ее участок. Охватываемый контигом участок измеряется в п.н. До полной расшифровки генома человека контига служили основой для построения окончательных вариантов физических карт. Контиги были получены на основе YAC-, ВАС-, РАС-, Pl-Д- и космидных библиотек ДНК человека.

Для построения контигов из геномных библиотек, содержащих крупные вставки (YAC-, ВАС-, РАС-библиотеки), используют метод картирования, основанный на обнаружении в индивидуальных клонах библиотеки различных маркерных сайтов (STS). Таких сайтов (как правило, это короткие тандемные повторы 2—4 нуклеотидов) в геноме человека идентифицировано около 10 000. Зная распределение маркеров в клонах, рассчитывают вероятный набор перекрывающихся клонов и определяют относительное расположение имеющихся маркерных сайтов.

Контиги из небольших фрагментов ДНК, полученные из Р1-, Х- и космидных библиотек, более удобны. Наиболее часто для построения контигов используют космидные библиотеки, перекрывающиеся клоны которых идентифицируют методом геномной дактилоскопии. ДНК каждого клона, обработанная рестриктазой, формирует уникальный набор фрагментов, выявляемых на электрофореграмме или радиоавтографическими методами, в зависимости от способа нанесения метки. Для организации контига из анализируемых клонов проводят поиск меченых рестрикционных фрагментов (общих для пары клонов) с помощью компьютерных программ. Наличие перекрывающихся участков в клонах контига подтверждается построением их рестрикционной карты.
Пробелы между контигами (поиск недостающих участков) заполняют путем скрининга библиотек из крупных вставок, используя зонды из ближайших концов соседних контигов.

Процесс определения места положения и взаиморасположения генов, кДНК или каких-либо маркеров (сайтов узнавания рестриктазами, STS-маркеров), присутствующих в исследуемой молекуле ДН К., называют физическим картированием.

Генетические карты и методы их построения. Построение генетических карт основано на анализе сцепления полиморфных маркеров с хромосомами и сцепления определенных генов с этими маркерами. Оценку сцепления между генами проводят на основании статистического анализа сегрегации признаков в родословной методом максимального правдоподобия, подсчитывая десятичный логарифм шансов (log of the odds), или LOD-балл. Шансы рассчитывают как отношение вероятности наблюдения родословной с наличием сцепления двух генов (частота рекомбинации меньше 0,5) к вероятности наблюдения родословной с отсутствием сцепления этих генов (частота рекомбинации равна 0,5). Гены сцеплены при LOD > +3, и не сцеплены -при LOD < —2. Методика анализа сцепления подробно описана в нашей статье.

Методика построения генетических карт включает: формирование групп сцепления генов, контролирующих различные наследственные признаки; исследование взаимного расположения генов в этих группах и определение соответствия между генетическими группами сцепления и цитогенетически идентифицируемыми фрагментами или целыми хромосомами. Для построения полных карт сцепления необходимо наличие в локусах каждой хромосомы часто встречающихся аллелей (маркеров), принадлежность которых можно идентифицировать. Для картирования генома человека в качестве таких маркеров в основном используют минисателитные повторы типа STR (от англ. short tandem repeals).

Карты сцепления хромосом человека постоянно обновляются по мере идентификации дополнительных полиморфных маркеров и локализации признаков. В результате разрешение карты постоянно повышается. К настоящему моменту в геноме человека установлена локализация примерно 6 000 полиморфных ДНК-маркеров, среднее расстояние между которыми =1 сМ, На таком участке может локализоваться около 10 генов.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."

Оглавление темы "ДНК анализ. Карты генома.":
1. Методы поиска и выделения фрагментов ДНК. Гибридизация с ДНК-зондами.
2. Клонирование. Принципы и методы клонирования.
3. Клонирование методом прыжков. Создание и скрининг библиотек генов.
4. Методы поиска ДНК последовательностей. Принципы полиморфизма генома.
5. Анализ мини- и микросателлитных маркеров ДНК. Геномная дактилоскопия.
6. Методы выявления мутаций. ПЦР анализ и его роль в выявлении мутаций.
7. Выявление точковых мутаций. Методы диагностики точковых мутаций.
8. Секвенирование ДНК. Этапы секвенирования ДНК.
9. Картирование и скрининг генома. Карта генома.
10. Макрорестрикционные карты. Контиг. Генетические карты и методы их построения.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: