Методы выявления мутаций. ПЦР анализ и его роль в выявлении мутаций.

Наиболее эффективный способ выявления мутаций - секвенирование кДНК или отдельных экзонов. Довольно часто первичный поиск нарушений в колирующих областях гена осуществляют именно таким образом. Для генов, имеющих сравнительно небольшие размеры (например, ген фактора IX свертывания крови, детерминирующий гемофилию В), метод прямого секвенирования иногда используют как основной метод сканирования мутаций. Однако, несмотря на наличие методик (различные модификации ПЦР, использование мРНКлля получения кДНК), переводящих секвенирование в разряд рутинных методов, секвенирование полноразмерной кДНК (т.е. всех экзонов) для выявления мутаций у отдельных индивидов остается трудоемкой, дорогой и требующей больших затрат времени процедурой.

Поэтому на практике полученные путем амплификации или клонирования фрагменты ДНК предварительно тестируют на наличие мутаций более простыми методами, основанными на сравнении физико-химических характеристик мутантных и нормальных последовательностей. Однако точные молекулярные характеристики каждой мутации независимо от ее природы (замены нуклеотидов, делеции, дупликации, инсерции и др.), могут быть получены только путем прямого секвенирования.

С помощью ПЦР и последующего электрофореза продуктов амплификации в полиакриламидном или агарозном геле обанаруживают мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов. К таким мутациям относятся делеции и инсерции.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Делеции регистрируют по разнице в размерах и числе амплифицированных фрагментов на электрофореграмме нормального и мугантного образцов ДН К. При отсутствии делеции на электрофореграмме выявляются все амплифицированные фрагменты в виде соответствующих полос.

Небольшие по размеру делеции и инсерции лишь слегка меняют размеры амплифицированных фрагментов ДНК. Именно гак была обнаружена в гене муковисцидоза деления трех нуклеотидов F508.

Протяженные делеции в генах, находящихся в состоянии геми- или гомозиготности, выявляют при электрофорезе продуктов мультиплексной амплификации экзонов, наиболее подверженных такой мутации. Если в исследуемом образце ДНК какие-то экзоны делегированы, то на электрофореграмме соответствующие им полосы отсутствуют. Используя перекрывающиеся участки гена для амплификации, можно оценить размер делеции и определить ее внутригенную локализацию. Этот метод применяют для выявления делеции в гене истрофина.

Для обнаружения протяженных делений, находящихся в гетерозиготном состоянии, используют мультиплексную ПЦР с обязательной количественной оценкой результатов амплификации (количественная ПЦР). Этот метод основан на амплификации кДНК, полученной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей или культур клеток пациента. В качестве олигопраймеровдля ПЦР используют последовательности из фланкирующих делецию экзонов гена.

При амплификации будут получены лишь фрагменты мугантной молекулы кДНК, небольшие по размеру вследствие близкого расположения граничащих с делецией экзонов. Участок между фланкирующими делецию экзонами в нормальной молекуле кДН К может быть слишком великдля амплификации при выбранных условиях,

На практике проводят мультиплексную ПЦР с использованием набора олигопраймеров, обеспечивающего амплификацию фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Наличие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации необычного размера.

- Читать далее "Выявление точковых мутаций. Методы диагностики точковых мутаций."

Оглавление темы "ДНК анализ. Карты генома.":
1. Методы поиска и выделения фрагментов ДНК. Гибридизация с ДНК-зондами.
2. Клонирование. Принципы и методы клонирования.
3. Клонирование методом прыжков. Создание и скрининг библиотек генов.
4. Методы поиска ДНК последовательностей. Принципы полиморфизма генома.
5. Анализ мини- и микросателлитных маркеров ДНК. Геномная дактилоскопия.
6. Методы выявления мутаций. ПЦР анализ и его роль в выявлении мутаций.
7. Выявление точковых мутаций. Методы диагностики точковых мутаций.
8. Секвенирование ДНК. Этапы секвенирования ДНК.
9. Картирование и скрининг генома. Карта генома.
10. Макрорестрикционные карты. Контиг. Генетические карты и методы их построения.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: