Анализ мини- и микросателлитных маркеров ДНК. Геномная дактилоскопия.

В настоящее время хорошо известно, что в некодирующих областях генома присутствуют так называемые тандемные повторы. Эти повторы представляют собой последовательности, состоящие из различного количества мономеров. Мономеры в свою очередь могут содержать от одного и до нескольких десятков нуклеотидов. Эффективность использования мини- и микросателлитных последовательностей (маркеров) в ДНК-диагностике обусловлена относительно равномерным распределением их на хромосомах и большим разнообразием.

Полиморфизм мини- и микросателлитных повторов настолько высок, что на хромосомах разного происхождения (мать/отец), как правило, эти участки содержат разное количество мономеров, (т.е. отличаются по длине), что позволяет различать хромосомы при семейном анализе, прослеживая их передачу в поколениях, и при идентификации принадлежности биологического образца (например, пострадавший/подозреваемый). Информативность таких многоаллельных маркеров значительно выше (уровень гетерозиготности достигает 70—90%), чем диаллельных (точковых замен), а характер расположения полос минисателитных ДНК на электрофореграмме («ДНК-отпечаток») индивидуален практически также как и отпечатки пальцев (вероятность идентичности двух индивидов в популяции составляет 10-5- 10-8), что позволило дать название методу - геномная дактилоскопия (genetics fingeprinting).

«Классический» метод геномной дактилоскопии представляет собой гибридизацию по Саузерну фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции и разделения в агарозном геле, В качестве зондов для гибридизации используется минисателлитная ДНК с длиной мономера от 9 до 40 п.н. и количеством его повтора от 10 до 30. Для установления или опровержения идентичности исследуемых образцов ДНК необходима последовательная гибридизация с 4-5 радиоактивно меченными зондами. После каждой гибридизации на радиоавтографе визуализируют и сравнивают между собой наборы различающихся по длине фрагментов, соответствующих минисателлитным последовательностям образцов ДНК.

геномная дактилоскопия

К недостаткам данной методики идентификации биологического материала можно отнести значительную длительность исследования (от нескольких недель до нескольких месяцев) и необходимость достаточно большого количества ДНК.

В последние годы для обнаружения различных мини- и микросателлитных последовательностей стали использовать различные модификации полимеразной цепной реакции (мультиплексная ПЦР, ПЦР с использованием меченых нуклеотидов), На сегодняшний день наиболее эффективным (т.е. достоверным, не требующим большого количества биологического материала и достаточно быстрым) методом идентификации личности считается сравнительный электрофоретический анализ фрагментов ДНК, полученных в результате мультиплексной ПЦР STR (от англ. short tandem repeals)-последовательностей - тримерных и тетрамерных коротких тандемных повторов. Пример установления биологического родства (диагностики отцовства) данным методом представлен на рисунке. Одна половина полос «ДНК-отпечатка» ребенка должна соответствовать таковым у отца, а другая — у матери.

Аналогичные методики используются и для ДНК- диагностики заболеваний. При прямой ДНК-диагностике, например, болезней, обусловленных экспансией тринуклеотидных повторов (STR) в регуляторных или транскрибируемых частях генов, выбор метода анализа количества повторов зависит от их протяженности: при числе повторов менее 200 для генотипирования аллелей используют электрофоретический анализ амплифицированных STR, в случаях больших размеров участка повторов используют метод блот-гибридизации с соответствующими зондами.

Для косвенной диагностики наследственных заболеваний применяют анализ количества микросателлитных (динуклеотидных) повторов. Наиболее часто используют СА-повторы, локализованные в интронах исследуемых генов или в непосредственной близости от кодирующей части гена.

Анализ полиморфизма мини- и микросателлитных последовательностей незаменим и при картировании. Определив генотипы всех членов родословной, можно установить сцепление маркера с геном заболевания.

- Читать далее "Методы выявления мутаций. ПЦР анализ и его роль в выявлении мутаций."

Оглавление темы "ДНК анализ. Карты генома.":
1. Методы поиска и выделения фрагментов ДНК. Гибридизация с ДНК-зондами.
2. Клонирование. Принципы и методы клонирования.
3. Клонирование методом прыжков. Создание и скрининг библиотек генов.
4. Методы поиска ДНК последовательностей. Принципы полиморфизма генома.
5. Анализ мини- и микросателлитных маркеров ДНК. Геномная дактилоскопия.
6. Методы выявления мутаций. ПЦР анализ и его роль в выявлении мутаций.
7. Выявление точковых мутаций. Методы диагностики точковых мутаций.
8. Секвенирование ДНК. Этапы секвенирования ДНК.
9. Картирование и скрининг генома. Карта генома.
10. Макрорестрикционные карты. Контиг. Генетические карты и методы их построения.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: