Методы поиска и выделения фрагментов ДНК. Гибридизация с ДНК-зондами.

Длительное время, до разработки ПЦР, единственными методами обнаружения и выделения специфических фрагментов ДНК (геномных и кДНК)с целью их последующего изучения были гибридизация с ДНК-зондами и клонирование, несмотря на целый ряд ограничений их применения. К основным ограничениям относятся следующие: большой размер исследуемых фрагментов, значительно превосходящий длину ДНК-зондов и препятствующий прямому молекулярному анализу; невозможность произвольного выбора концов изучаемых последовательностей, определяющихся наличием соответствующих сайтов рестрикции в исходной молекуле ДНК; необходимость большого количества хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК (не менее 10 мкг на одну реакцию, что равноценно 0,5—1 мл крови), для геномной гибридизации — наличие радиоактивных ДН К-зондов с высокой удельной активностью не менее 109 имп./мин*мкг), действующих ограниченный промежуток времени, и специально оборудованного изотопного блока. К тому же длительная экспозиция автографов значительно удлиняет время получения результатов.

Все это, атакже большая трудоемкость исследований, ограничивают использование методов блот-гибридизации и клонирования для пренатальной диагностики плода (ответ в этом случае надо получить быстро) и диагностики наследственного заболевания при гибели больного в этом случае невозможно получить большое количество ДНК). Однако эти методы не потеряли своей актуальности и используются для картирования и изучения новых генов.

ДНК-зонд — одноцепочечная ДНК, длиной до 30 нуклеотидов, используемая для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большего размера или среди множества разнообразных молекул ДНК. ДНК-зонды можно синтезировать искусственно либо выделить из генома. Затем эти последовательности клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном количестве.

Блот-гибридизация. Это высокочувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДН К, Денатурированные фрагметы ДНК переносят на плотный носитель - нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану. Далее фиксированную на этом носителе ДНК гибридизуют с радиоактивно меченным ДНК- или РНК-зондом. Затем положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме определяют методом радиоавтографии. При длительной экспозиции (в течение нескольких дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК-зонда (более 109 расп/мин*мкг)) этот метод позволяет выявлять менее чем 0,1 пг ДНК. Этапы блот-гибридизации схематически представлены на рисунке.

фрагменты днк

В зависимости от типа изучаемого вещества, способов его предварительной обработки и переноса (блоттинга) различают несколько разновидностей этого метода.
Саузерн-блот, или блот-гибридизация по Саузерну — наиболее эффективный метод идентификации определенных молекул ДНК среди электрофоретически разделенных фрагментов, предложенный в 1975 г. Эдвардом Саузерном. Геномную ДНКобрабатывают одной или несколькими рестриктазами и образовавшиеся фрагменты разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном геле. Далее фрагменты ДНК подвергают денатурации in situ и переносят с геля на плотный носитель. В данном случае блоттинг (перенос) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума.

Методы дот- и слот-гибридизации получили свои названия в зависимости от формы анализируемого пятна ДНК на фильтре - округлой или продолговатой, соответственно. На твердую матрицу препараты ДНК и РНК наносятся капельно. Принципиальное отличие этих методов в том, что с меченым ДНК-зондом гибридизуются молекулы ДНК или РНКбез предварительной обработки рестриктазами и электрофореза.

Нозерн-блот (Northern-blot) - метод гибридизации ДН К-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК.
Вестерн-блот (Western-blot), или иммуноблот, - это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах, с мечеными антителами.

Названия двух последних методов образованы по аналогии с Саузерн-блот (Southern-blot)- Их можно рассматривать как дань уважения сообщества молекулярных генетиков Эдварду Саузерну, внесшему неоценимый вклад в разработку методов, используемых для анализа ДНК.

Перечисленные виды блот-гибридизации имеют ряд недостатков: необходимость использования хорошо очищенных препаратов ДНК и радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость процедуры. Все это делает данные методы весьма дорогостоящими. Тем не менее, блот-гибридизация не утратила своего значения и в настоящее время. Использование различных вариантов нерадиоактивного мечения (биотин- или флуоресцеин-меченные ДНК-зонды) или окраски ДНК нитратом серебра позволяет применять этот метод для диагностики генных болезней.

Гибридизация in situ. Метод гибридизации с ДНК-зондами на гистологических или хромосомных препаратах (т.е. метод гибридизации, не требующий предварительного выделения и очистки ДНК). В настоящее время наиболее широко используется FISH (от англ. fluorescent in situ hybridization) — вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, меченные флуорохромами.

Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. После удаления не связавшихся молекул ДНК и специфической обработки, в зависимости от типа использованного зонда, места хромосомной локализации последовательностей ДНК, комплементарных соответствующим ДНК-зондам, наблюдают в микроскоп в виде характерных светящихся точек. Гибридизация in situ - один из наиболее эффективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду последовательностей ДНК на хромосомах. Его применяют при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения; при определении хромосомной принадлежности и внутрихромосомной локализации уникальных генов, взаиморасположения клонированных фрагментов ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса. Разрешающая способность FISH-метода достигает нескольких хромосомных бэндов: при проведении гибридизации in situ на интерфазных (растянутых) хромосомах человека она может достигать 50 т.п.н., что составляет около 5% величины среднего хромосомного бэнда.

Гибридизация in situ молекул РНК с кДНК-зондами, проводимая на гистологических препаратах, эффективно используется для анализа тканеспецифического распределения и внутриклеточной локализации мРНК.

- Читать далее "Клонирование. Принципы и методы клонирования."

Оглавление темы "ДНК анализ. Карты генома.":
1. Методы поиска и выделения фрагментов ДНК. Гибридизация с ДНК-зондами.
2. Клонирование. Принципы и методы клонирования.
3. Клонирование методом прыжков. Создание и скрининг библиотек генов.
4. Методы поиска ДНК последовательностей. Принципы полиморфизма генома.
5. Анализ мини- и микросателлитных маркеров ДНК. Геномная дактилоскопия.
6. Методы выявления мутаций. ПЦР анализ и его роль в выявлении мутаций.
7. Выявление точковых мутаций. Методы диагностики точковых мутаций.
8. Секвенирование ДНК. Этапы секвенирования ДНК.
9. Картирование и скрининг генома. Карта генома.
10. Макрорестрикционные карты. Контиг. Генетические карты и методы их построения.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: