Картирование и скрининг генома. Карта генома.

Секвенирование к 2003 г, всего генома человека позволило значительно облегчить процедуру картирования, так как анализируя уже известную нуклеотидную последовательность определенного региона можно более точно и быстро выбрать ген-кандидат для подтверждения его роли в развитии наследственного заболевания.

Расшифровка генома позволила упростить и процесс построения физических карт. Однако знания первичной структуры ДНК не достаточно для определения функциональной роли той или иной нуклеотидной последовательности. На повестке дня формирование нового направления программы «Геном человека» - функциональной геномики. В связи с этим построение/обновление карт генома не потеряло своей актуальности.

Карта генома - это схема, определяющая хромосомную принадлежность и взаиморасположение (порядок и расстояние) генов и других компонентов генома. Карты генома можно классифицировать по объему предоставляемой информации (разрешаюшей способности) и методам построения. В зависимости от разрешающей способности выделяют мелкомасштабные карты (с низким уровнем разрешения), например, картина дифференциального окрашивания хромосом или генетические карты с расстоянием между соседними маркерами в 7—10 миллионов п.н. (мегабаз -Мб), и крупномасштабные, в идеале — полная последовательность нуклеотидов.

По методам построения различают физические и генетические карты (карты сцепления). Физические карты целой хромосомы или ее сегмента строятся на основе прямого исследования генетического материала и дают представление о реальном расположении генов в ДНК, расстояние между которыми и фланкирующими их маркерами выражается в п.н., что облегчает их идентификацию и изучение, атакже секвенирование. Генетические карты показывают линейное расположение маркерных сайтов, расстояние между которыми измеряют в сМ (сантиморган - условная единица частоты рекомбинации).

картирование и скрининг генома

Расстояние между локусами равно 1сМ при частоте рекомбнации 1% и соответствует физическому расстоянию приблизительно в 1 Мб (1 млн. п.н.). Частоты рекомбинации, а значит и реальная длина 1сМ, варьируют в различных частях генома, что обусловливает возможность получения лишь ориентировочной информации о физическом (реальном) расстоянии при использовании генетических карт.

Физические карты хромосом и методы их построения. В зависимости от используемого метода можно получить физические карты хромосом с различной степенью разрешения. Соответственно этому выделяют мелкомасштабные физические карты, к которым относятся цитогенетические (хромосомные) итранскрипционные (карты кДНК), и крупномасштабные - макрорестрикционные карты и карты контиг. Физические карты можно построить как для всего генома, так и для изолированной хромосомы.

Изолированные хромосомы можно получить путем сортировки хромосом в потоке по размеру (проточная цитометрия), а также из гибридных клеточных линий (гибрид| [ые клетки «человек х мышь» при делении теряют преимущественно человеческие хромосомы, в результате чего остается лишь одна хромосома, такую гибридную клетку размножают и поддерживают клеточную линию). При необходимости получения больших количеств определенного фрагмента ДНК при построении крупномасштабных карт используют методы ПЦР и клонирования,

Цитогенетические карты дают информацию о расположении гена на хромосоме относительно ее участков, идентифицируемых методами дифференциального окрашивания. Благодаря такому окрашиванию хромосома в поле зрения микроскопа выглядит «поперечно исчерченной». Расположение окрашенных участков (бэндов) специфично для каждой хромосомы. Использование FISH-метода позволяет построить цитогенетические карты с разрешением 2—5 Мб, а его модификации для интерфазных хромосом - 0, 1 Мб. Таким образом, локализация картированного с помощью FISH-метода гена может быть установлена с точностью до субсегмента и локусабэнда.

Например, согласно принятой цитогенетической номенклатуре ISCN-1995 и номенклатуре используемых в качестве маркеров сегментов ДНК с неизвестной функцией, запись 22ql 1.2 (D22S75) означает, что ген локализован во 2-ом субсегменте 1-ого сегмента 1-го района длинного плеча хромосомы 22 методом гибридизации in situ в локусе D22S75 (D - ДНК, 22 - № хромосомы, S - уникальный маркер, 75 - № зонда в данном районе хромосомы).

Транскрипционные карты предоставляют информацию о расположении на хромосоме кДНК, что позволяет выявлять гены-кандидаты для тех или иных заболеваний. Искусственно синтезированные с использованием в качестве матрицы мРНК или химическим путем (по известной аминокислотной последовательности) и меченые кДНК-зонды локализуют методом гибридизации in situ, фугой, более перспективный, метод построения транскрипционной карты основан на частичном секвенировании отдельных кДНК-клонов и выявлении специфических маркерных сайтов (STS — sequence tagged sites), называемых экспрессируемыми маркерными сайтами (eSTS).

Для определения хромосомной принадлежности eSTS-сайта проводят ПЦР с ДНК монохромосомных гибридов с использованием eSTS-праймеров. Далее, проводят ПЦР с ДНК клеточных линий гибридных клеток, содержащих только определенные фрагменты конкретной хромосомы человека, и устанавливают локализацию eSTS на хромосоме. Также картирование можно осуществить нанеся eSTS методом гибридизации in silu на карты радиационных гибридов.

- Читать далее "Макрорестрикционные карты. Контиг. Генетические карты и методы их построения."

Оглавление темы "ДНК анализ. Карты генома.":
1. Методы поиска и выделения фрагментов ДНК. Гибридизация с ДНК-зондами.
2. Клонирование. Принципы и методы клонирования.
3. Клонирование методом прыжков. Создание и скрининг библиотек генов.
4. Методы поиска ДНК последовательностей. Принципы полиморфизма генома.
5. Анализ мини- и микросателлитных маркеров ДНК. Геномная дактилоскопия.
6. Методы выявления мутаций. ПЦР анализ и его роль в выявлении мутаций.
7. Выявление точковых мутаций. Методы диагностики точковых мутаций.
8. Секвенирование ДНК. Этапы секвенирования ДНК.
9. Картирование и скрининг генома. Карта генома.
10. Макрорестрикционные карты. Контиг. Генетические карты и методы их построения.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: