Методы поиска ДНК последовательностей. Принципы полиморфизма генома.

Последовательности ДНК человека идентичны между собой на 99,8%, однако, оставшиеся 0,2% генома человека характеризуются значительной вариабельностью. Исследования генома, позволившие установить наличие вариабельных участков, а также широкое внедрение метода ПЦР, позволили разработать более легкие методы идентификации фрагментов ДНК, основанные на полиморфизме генома. Эти методы имеют ряд преимуществ: 1) можно использовать один и тот же (универсальный) набор праймеров, 2) нет необходимости в ДНК-зондировании, гибридизации и т.д., 3) возможность автоматизации анализа результатов. Все это позволяет быстро охарактеризовать большое количество образцов.

Как известно, полиморфизм генома обусловлен, главным образом, наличием полиморфных локусов, представляющих собой нейтральные мутации, не проявляющиеся фенотипически и не влияющие на жизнеспособность и репродуктивные свойства особей. Такие локусы сконцентрированы в некодируюших областях генома человека, более подверженных изменчивости, чем кодирующие участки. Наследование полиморфных локусов подчиняется менделевским закономерностям. Информативность полиморфных локусов определяется уровнем их генетической изменчивости в различных популяциях.

С помощью молекулярных методов анализа наиболее просто выявляются два типа геномного полиморфизма: I) количественные изменения мини- и микросателлитных последовательностей ДИК (уменьшение или увеличение числа повторов), создающие целую серию уникальных по характеру и частоте аллелей для каждого вариабельного локуса, и 2) качественные замены отдельных нуклеотидов, обусловливающие появление полиморфных сайтов рестрикции. Эти типы полиморфных локусов представляют собой наиболее удобные генетические маркеры. Анализируя родословные можно проследить наследование аллелей этих маркеров в ряду поколений, определить сцепление друг с другом, с известными генами и с анонимными последовательностями ДНК, что широко используется как для картирования геномов, так и для косвенной диагностики наследственных заболеваний.

Феномен ДНК-полиморфизма лежит в основе двух распространенных в настоящее время методов идентификации мутантных фрагментов ДНК: анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и анализа микросателлитных маркеров.

Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Присутствие в геноме полиморфных сайтов рестрикции обусловливает вариацию (полиморфизм) длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). В геноме человека такие полиморфные сайты рестрикции встречаются во всех хромосомах с частотой приблизительно 1 : 300 - 500 п.н.

Этот метод используется для предварительного уточнения локализации мутации при наличии в амплифицированном фрагменте известных сайтов рестрикции и для выявления уже известных точковых замен, меняющих сайт узнавания рестриктаз. Для этого продукты амплификации разрезают соответствующей рестриктазой и на электрофореграмме сравнивают длину изучаемых рестрикционных фрагментов с контролем. При необходимости полученные фрагменты идентифицируют, используя метод блот-гибридизации по Саузерну.

ПДРФ-анализ можно использовать для диагностики гетерозиготного носительства мутаций. При наличии точковых мутаций в гетерозиготном состоянии по данному сайту рестрикции на электрофореграмме будут выявляться три фрагмента: один - исходной длины и два- полученные после рестрикции. При наличии делеций в гетерозиготном состоянии наряду с фрагментами нормальной длины будут присутствовать и необычные по размеру. Выявление полиморфного сайта в гетерозиготном состоянии позволяет отличить мутантный аллель от нормального, те. осуществить его молекулярную маркировку. Однако первичная идентификация полиморфного сайта рестрикции, сцепленного с определенным геном, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зондов.

ПДРФ-анализ применяют как для прямой (определяют уже известные нуклеотидные замены), так и для косвенной ДНК-диагностики. Косвенная диагностика проводится по полиморфным точкам, расположенным, как правило, в некодирующих областях либо в третьей букве вырожденного кодона, что позволяет различать материнскую и отцовскую хромосомы при семейном анализе в случае гетерозиготности по данному полиморфизму. С другой стороны, такие маркеры являются диаллельными, что приводит к невысокой гетерозиготности по данному локусу особей в популяции (не более 50%), что накладывает существенные ограничения на их использование (в связи с их низкой информативностью).

- Читать далее "Анализ мини- и микросателлитных маркеров ДНК. Геномная дактилоскопия."

Оглавление темы "ДНК анализ. Карты генома.":
1. Методы поиска и выделения фрагментов ДНК. Гибридизация с ДНК-зондами.
2. Клонирование. Принципы и методы клонирования.
3. Клонирование методом прыжков. Создание и скрининг библиотек генов.
4. Методы поиска ДНК последовательностей. Принципы полиморфизма генома.
5. Анализ мини- и микросателлитных маркеров ДНК. Геномная дактилоскопия.
6. Методы выявления мутаций. ПЦР анализ и его роль в выявлении мутаций.
7. Выявление точковых мутаций. Методы диагностики точковых мутаций.
8. Секвенирование ДНК. Этапы секвенирования ДНК.
9. Картирование и скрининг генома. Карта генома.
10. Макрорестрикционные карты. Контиг. Генетические карты и методы их построения.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: