Клонирование методом прыжков. Создание и скрининг библиотек генов.

Метод клонирования способом «прыжков по хромосоме» позволяет идентифицировать участки, отстоящие друг от друга на сотни тысяч нуклеотидов, не выделяя промежуточную последовательность. Для создания библиотеки генов методом «прыжков по хромосоме» проводят рестрикцию геномной ДНК редкощепящей рестриктазой (как правило, наиболее удобен фермент, сайты рестрикции которого находятся на расстоянии примерно 200 т.п.н. —длина прыжка). Эти фрагменты сшивают с небольшим маркерным геном, как правило с геном supF (длина =7 т.п.н.) фага X, что приводит к циклизации фрагмента. В результате этого концевые участки, исходно находившиеся на расстоянии несколько сотен т.п.н. удалены друг от друга лишь на длину маркерного гена. Обработав кольцевые молекулы среднещепящей рестриктазой (наиболее часто используют EcoR1), отбирают фрагменты длиной примерно 20 т.п.н., среди которых и содержащие маркерный ген и фланкирующие его последовательности. При встраивании в вектор амплифицироваться в клетках-хозяевах отрицательных по маркерному гену будут только последовательности, содержащие этот ген.

Далее идентифицируют клон методом гибридизации с ДНК-зондом, специфичным для исходной последовательности. При последующем субклонировании в плазмидном векторе получают два субклона. Один субклон гибридизуется с ДНК-зондом, специфичным для исходной последовательности, второй - не гибридизуется с этим ДНК-зондом и содержит фрагмент ДНК, отстоящий от начала исходной молекулы на длину прыжка.
После создания геномных библиотек, содержащих большие фрагменты ДНК, и построения карт контиг методы «прогулки» и «прыжков по хромосоме» утратили свою актуальность.

Библиотеки генов и их скрининг. На основе технологии клонирования, позволяющей обнаруживать определенный фрагмент ДНК и получать его в необходимом количестве, сконструированы библиотеки генов, служащие источником различных фрагментов ДНК. Библиотека генов - это полный набор клонированных перекрывающихся ДНК-фрагментов, которые получены в результате рестрикции или механического разрезания исходной молекулы ДНК, выделенной из какого-либо биологического материала (тканей, культур клеток, отдельной хромосомы или из ее фрагментов). Количество различных клонов, или информационная емкость библиотеки, зависит от размера исходной ДНК (генома) и обязательности присутствия каждого фрагмента хотя бы в одном клоне. Оптимальный размер перекрывающихся фрагментов для клонирования при создании библиотеки генов должен соответствовать среднему размеру гена того вида или типа живых организмов (для млекопитающих — 15—25 т.п.н.), для которого она создается.
Библиотека может содержать всю геномную ДНК данного вида (экзоны, интроны и межгенные участки) или только кодирующие последовательности.

клонирование

Библиотеки, созданные на основе тотальной геномной ДНК и включающие экзоны, интроны и межгенные участки называют геномными. Информационная емкость геномных библиотек млекопитающих составляет не менее 8*105-106 . Фрагменты оптимального размера из геномной ДНК человека получают при рестрикции частощепящимирестриктазами Say 3A или Mbol.

Библиотеки кДНК состоят только из экзонов. Их конструируют из кДНК, полученной с помощью обратной транскрипции мРНК, которая выделена из биологического материала, экспрессирующего изучаемые гены. Различают библиотеки экс-прессирующихся кДНК и селективных кДНК.

Получив ДНК/кДНК, ее разрезают на фрагменты, длина которых зависит от выбранного клонирующего вектора, и конструируют векторную систему, В зависимости от выбранного для клонирования вектора различают YAC-, ВАС (bacterial artificial chromosomes)- и РАС (plasmid artificial chromosomes)-библиотеки, содержащие крупные фрагменты ДНК человека. Фаговые и космидные библиотеки генов наиболее удобны для хранения больших количеств химерных ДНК. Для создания библиотек генов в основном используют фаговые, космидные и YAC-системы. YAC-библиотеки генов представляют собой фрагменты геномной ДНК человека размером до 1 млн п,н., «сшитые» с центромерными районами хромосом дрожжей. После идентификации необходимого клона YAC-библиотеки вставочный участок может быть субклонирован в фаговых или космидных библиотеках. Наиболее удобно библиотеки генов человека конструировать, используя клонирующие векторы на основе фага X - EMBL3 и EMBL4. Это обусловлено характеристиками векторов: интервалом пакующей способности - 9-23 т.п.н.; наличием большого количества удобных клонирующих сайтов (что позволяет использовать разные рестриктазы при получении фрагментов ДНК для инсерции); отсутствием последовательностей плазмид pBR322 и ColE1, наиболее часто используемых для клонирования (что позволяет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не вырезая вставку).

Скринируя библиотеки генов, осуществляют поиск нужных последовательностей ДНК Выбор метода скрининга зависит от специфических особенностей этих последовательностей. Для скрининга библиотек, как правило, используют блот-гибридизацию с ДНК-зондами (олигонуклеотидными, к ДНК- и другими) или иммунноблот со специфическими антителами (если библиотека сконструирована на основе экспреccирующего вектора). Скрининг включает несколько последовательньгх этапов: высевание химерных фагов библиотеки на газон бактерий, растущих на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри (каждая литическая бляшка на бактериальном газоне - результат инфицирования клеток одним клоном фага); «перепечатывание» полученных культур на другие чашки Петри с целью их дублирования; перенос растущих и лизированных исходных колоний на фильтр с одновременным разрушением клеточных мембран, фиксированием белков и ДНК; блот-гибридизация с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными антителами (для экспрессионных библиотек). Заключительный этап скрининга включает выявление положительных колоний фагов методом радиоавтографии (после удаления несвязавшихся ДНК-зондов и антител темные пятна на рентгеновской пленке обнаружатся в местах локализации колоний, содержащих комплементарный зонду фрагмент ДНК, или специфический антиген) и их отбор на дублированных культурах. С целью избежания ошибок проводят неоднократный скрининг отобранных колоний.

Далее для получения достаточного количества отобранного фрагмента с целью его исследования или использования в качестве ДНК-зонда его субклонируют в плазмидном векторе.

- Читать далее "Методы поиска ДНК последовательностей. Принципы полиморфизма генома."

Оглавление темы "ДНК анализ. Карты генома.":
1. Методы поиска и выделения фрагментов ДНК. Гибридизация с ДНК-зондами.
2. Клонирование. Принципы и методы клонирования.
3. Клонирование методом прыжков. Создание и скрининг библиотек генов.
4. Методы поиска ДНК последовательностей. Принципы полиморфизма генома.
5. Анализ мини- и микросателлитных маркеров ДНК. Геномная дактилоскопия.
6. Методы выявления мутаций. ПЦР анализ и его роль в выявлении мутаций.
7. Выявление точковых мутаций. Методы диагностики точковых мутаций.
8. Секвенирование ДНК. Этапы секвенирования ДНК.
9. Картирование и скрининг генома. Карта генома.
10. Макрорестрикционные карты. Контиг. Генетические карты и методы их построения.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: