Клонирование. Принципы и методы клонирования.

Клонирование - один из методов выделения и идентификации фрагментов ДНК, а также получения их в неограниченном количестве. Выделенные и идентифицированные фрагменты могут быть использованы для молекулярного анализа, в качестве ДНК-зондов и ддя создания библиотек генов. Метод был разработан на бактериях и свое название получил из-за того, что все производные одной бактериальной колонии содержат идентичные фрагменты ДНК, т.е. представляют собой клоны.

Клонирование фрагмента ДНК включает несколько последовательных этапов:
1) встраивание клонируемого (чужеродного) фрагмента ДНК в векторную молекулу ДНК (образование химерной молекулы - рекомбинантной ДНК);
2) проникновение этой конструкции в бактериальную клетку-хозяина;
3) идентификация клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, и их отбор (как правило, осуществляется на селективной среде);
4) получение необходимого количества клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (собственно клонирование). При необходимости индуцируют экспрессию клонированного гена в клетках-хозяевах и получают кодируемый им белок.

клонирование

Итак, клонирование предполагает встраивание (инсерцию) экзогенной ДНК в векторную молекулу ДНК. Векторные системы, обеспечивающие доставку чужеродного фрагмента ДНК в клетку хозяина, для прокариот и эукариот различны. Для клонирования в прокариотических клетках используют плазмиды, фаги и космиды. В зависимости от типа векторной системы, используемой для доставки клонируемого фрагмента ДНК, процесс переноса генов носит название: при использовании плазмиды — трансформации; при использовании фага - трансдукции. Перенос экзогенной ДНК в эукариотические клетки называют трансфертен. В качестве векторов для переноса ДНК в эукариотические клетки используют дрожжевые плазмиды (единственные плазмиды, найденные в эукариотических клетках) и различные эукариотические вирусы (чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аденоассоциированные вирусы). В ряде случаев введение векторных конструкций в эукариотические клетки осуществляют путем ко-трансформацый — одновременного введения плазмиды и сегмента чужеродной ДН К. В клетках эукариот векторные конструкции сохраняются в виде эписом (суперскрученных кольцевых молекул) в течение нескольких дней, а иногда экзогенная ДНК интегрируется в хромосомную ДНК и устойчиво сохраняется в геноме клетки-хозяина.

Конструирование клонирующих векторов подразумевает встраивание или удаление удобных для идентификации клонов генетических элементов (специфических сайтов рестрикции, инициации и регуляции транскрипции). Например, при создании плазмидных клонирующих векторов ослабляют систему контроля репликации и добавляют или вырезают гены антибиотикоустойчивости. При формировании фаговой векторной конструкции экзогенную ДНК встраивают в район локализации маркерного гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов по экспрессии химерного белка (часть полипептидной цепи соответствует маркерному белку, а часть -информации, заключенной во встроенном фрагменте ДНК). Определение химерного белка возможно при использовании антител к фрагменту маркерного белка или участку, кодируемому чужеродной ДНК, а также путем выявления функционально активного белка после протеолитического расщепления химерного полипептида. При конструировании искусственных дрожжевых хромосом YAC (от англ. yeast artificial chromosomes) используют плазмидные векторы, содержащие в своем составе известные центромерные и теломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые для поддержания репликации векторов в клетках хозяина. Характеристики клонирующих векторов представлены в таблице.

Некоторое время идентификация нужных геномных клонов проводилась очень трудоемкими методами - «прогулки» и «прыжков по хромосоме». Их этапы схематически представлены на рисунке.

«Прогулка по хромосоме», или скользящее зондирование, заключается в последовательном отборе клонов, несущих перекрывающиеся в концевых участках фрагменты ДНК из определенной области генома. Выделив клоны, например, путем скрининга библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцепленной с нужным геном, их используют в качестве ДНК-зондов для поиска других клонов с перекрывающимися последовательностями. Врезультате получают набор фрагментов, полностью перекрывающих область поиска гена, - контиги. С помощью методов физического картирования устанавливают размер перекрывающихся участков (в п.н.) и строят физическую карту данной области. Несмотря на то, что прогулку можно осуществлять в двух направлениях, при использовании рестрикциониой карты, эффективность этого метода мала. При использовании космидных библиотек каждый шаг зондирования в одном направлении равен 20 т.п.н. (0,02Мб), а из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей можно пройти около 200-300 т.п.н. (0,2-0,3 Мб).

- Читать далее "Клонирование методом прыжков. Создание и скрининг библиотек генов."

Оглавление темы "ДНК анализ. Карты генома.":
1. Методы поиска и выделения фрагментов ДНК. Гибридизация с ДНК-зондами.
2. Клонирование. Принципы и методы клонирования.
3. Клонирование методом прыжков. Создание и скрининг библиотек генов.
4. Методы поиска ДНК последовательностей. Принципы полиморфизма генома.
5. Анализ мини- и микросателлитных маркеров ДНК. Геномная дактилоскопия.
6. Методы выявления мутаций. ПЦР анализ и его роль в выявлении мутаций.
7. Выявление точковых мутаций. Методы диагностики точковых мутаций.
8. Секвенирование ДНК. Этапы секвенирования ДНК.
9. Картирование и скрининг генома. Карта генома.
10. Макрорестрикционные карты. Контиг. Генетические карты и методы их построения.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: