Возможность применения таких методов, как Саузерн- и Нозерн-блот-гибридизация, дот-блот-гибридизация, гибридизация на колониях и фаговых бляшках, картирование с помощью нуклеазы Sl/РНКазы, гибридизация in situ, определяется тем, есть ли достаточно простой способ мечения клонированных фрагментов ДНК или их РНК-копий. Чтобы выбрать оптимальную для каждого случая метку и способ мечения, надо учитывать ряд факторов.

Прежде всего тип метки определяется чувствительностью и разрешением, которые хотят получить. Существенны и другие факторы: стабильность зондов, безопасность и простота работы, стоимость.

Традиционно для получения РНК- или ДНК-зондов используют радиоактивно меченные с помощью 32Р, 3SS, 1251,3Н нуклеотиды, которые после гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой-мишенью выявляют методом радиоавтографии. Однако большинство этих изотопов имеют малый период полураспада (32Р — 14,3 сут, 35S — 87,4 сут), что влечет за собой необходимость частого приготовления зондов. Кроме того, работа с радиоизотопами требует соблюдения строгих мер безопасности, а мероприятия по захоронению радиоактивных отходов очень дороги.

Поиски эффективных нерадиоактивных маркеров, пригодных для мечения зондов, привели к созданию как минимум двух альтернативных меток: биотин-dNTP (bio-dNTP, фирмы Sigma и Gibco-BRL) и дигоксигенин-dUTP (dig-dUTP, фирма Boehringer Mannheim). Некоторые авторы, однако, считают, что неизотопные методы мечения не обеспечивают столь высокой чувствительности, специфичности и воспроизводимости результатов, как изотопные, особенно при гибридизации на фильтрах. Впрочем, это не относится к гибридизации in situ.

В основе большинства методов нерадиоактивного мечения лежат ферментативные реакции с участием нуклеозидтрифосфатов, ковалентно связанных с молекулой-свидетелем (обычно биотином). После гибридизации нерадиоактивно меченные зонды можно выявить с помощью неиммунологической системы детекции на основе авидина и стрептавидина (имеюших высокое сродство к биотину) или с помощью конъюгированных с флуоресцентным красителем или ферментом антител к зонду. Для визуализации меченых гибридных молекул проводят инкубацию конъюгированных с ферментом антител с соответствующим субстратом.

Зонды можно метить и химическими методами, используя биотин, пришитый к высокоактивным молекулам. Такие биотинилированные субстраты (например, фотобиотин, биотингидразид, эфир биотина) могут вступать в реакцию с одной из функциональных групп нуклеиновых кислот (например, с аминогруппой). Однако, чтобы эти методы могли конкурировать с ферментативными методами мечения, необходимо доказать, что они обеспечивают адекватные чувствительность и воспроизводимость.

К сожалению, биотин присутствует в большинстве тканей, так что даже при ферментативном мечении зондов биотином (особенно если эти зонды используются для гибридизации in situ) могут возникать побочные неспецифичные реакции. Кроме того, используемые для выявления гибридных молекул авидин и стрептавидин имеют тенденцию к неспецифическому связыванию с тканями и фильтрами (особенно с сильно заряженными найлоновыми), что неизбежно усиливает фон. Тем не менее разработано много эффективных методов выявления нуклеиновых кислот при гибридизации in situ с биотинилированными зондами.

Использование в качестве метки дигоксигенина, по-видимому, обеспечивает большую специфичность и воспроизводимость, а чувствительность метода близка к таковой для случая радиоактивно меченных зондов. Дигоксигенин присутствует только в растении дигиталис, что уменьшает неспецифичное окрашивание, обусловленное взаимодействием с эндогенными соединениями.

В дальнейших статьях будут описаны быстрые и легко выполнимые процедуры ферментативного мечения нуклеиновых кислот радиоактивными изотопами. В каждом случае указывается, какие модификации в них следует внести, если в качестве метки предполагается использовать биотин или дигоксигенин. Наборы для мечения ДНК выпускают фирмы Pharmacia и Amersham (радиоактивные изотопы) и BRL и Boehringer Mannheim (нерадиоактивные метки).

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."