Для выделения плазмид разработано несколько методов. Они различаются по чистоте конечного продукта, скорости выделения и возможности их использования для выделения плазмид из большого («maxiprep») и промежуточного («midiprep») объемов бактериальной культуры или для одновременного выделения плазмидной ДНК из большого числа культур малого объема («miniprep»).

Почти всегда для выделения плазмид используют культуры, растущие в содержащей соответствующий антибиотик жидкой среде и полученные наращиванием одной снятой с агара бактериальной колонии. Если плазмидные векторы (например, pUC) реплицируются в клетке с образованием большого числа копий, то соответствующие плазмиды можно получить в больших количествах из культур, выращенных в стандартной LB-среде до достижения поздней логарифмической фазы (примерно 18 ч).

Однако если используемый вектор реплицируется не столь бесконтрольно (как, например, плазмида pBR322), его приходится селективно амплифицировать инкубацией бактериальной культуры в течение нескольких часов в среде с хлорамфениколом (170 мкг/мл). Хлорамфеникол ингибирует синтез белков клетки-хозяина и тем самым нарушает репликацию бактериальной хромосомы. При этом репликация плазмид продолжается еще в течение нескольких часов, что позволяет значительно увеличить выход плазмидной ДНК по сравнению с неамплифицированными культурами.

Основные методы очистки плазмидной ДНК

Большинство методов вьщеления плазмид основаны на том, что последние имеют ковалентно замкнутую кольцевую форму (ССС) и гораздо меньшие размеры, чем бактериальная хромосома. Бактериальные клетки собирают центрифугированием и лидируют, обычно с помощью ЭДТА и лизоцима, разрушающего клеточную стенку. Можно также использовать органические растворители, нагревание, неионные детергенты. Фрагменты клеток и бактериальной хромосомы после лизиса удаляют центрифугированием.

Чаще всего при работе с культурами любого объема — как малого, так и большого — используется предложенный в работе щелочной метод вьщеления. В присутствии щелочи основная масса загрязняющих плазмидную ДНК фрагментов хромосомной ДНК, белков и РНК выпадает в осадок, так что получаемые препараты плазмидной ДНК оказываются достаточно чистыми для обработки рестриктирующими эндонуклеазами и последующего клонирования. Для дальнейшей очистки выделенной плазмидной ДНК можно провести центрифугирование в равновесном градиенте плотности в присутствии красителя.

В основе щелочного метода лежит то, что в щелочных условиях (при рН ~ 12) происходит денатурация только линейных молекул ДНК (т. е. разделение цепей двухцепочечной ДНК клетки-хозяина), плазмидные же ССС-молекулы не денатурируют. При нейтрализации клеточного экстракта в присутствии солей высокой концентрации денатурированная хромосомная ДНК выпадает в осадок, поскольку реассоциация длинных линейных одноцепочечных молекул ДНК происходит в этих условиях одновременно во множестве участков с образованием нерастворимых комплексов.

Клеточная РНК и белки тоже осаждаются вследствие того, что при осаждении используется детергент ДСН. В протоколе описан в деталях вариант этого метода для вьщеления небольших количеств плазмидной ДНК из Е. coli K12, а в протоколе — метод получения больших количеств более чистой плазмидной ДНК, включающий центрифугирование в равновесном градиенте плотности в присутствии красителя.

- Читать далее "Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры"