В буферах с высокой ионной силой poly(A)+-хвост полиаде-нилированной РНК образует комплекс с oligo(dT), ковалентно связанной с твердой матрицей (например, с целлюлозой). Это позволяет выделять мРНК из сложной популяции клеточных РНК. Если нанести на колонку с оligо(оТ)-целлюлозой суммарную клеточную РНК в буфере с высокой ионной силой, то на колонке задержится только poly(A)+-PHK, которую можно затем элюировать буфером с низкой ионной силой или водой и сконцентрировать переосаждением этанолом. Этот метод описан в протоколе.

Материалы
Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• 2 х буфер для нанесения: 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,2% (в/о) ДСН
• Oligо(аТ)-целлюлоза
• 5 М NaCl

Методика
1. Ресуспендируют 1 oligо(аТ)-целлюлозы в стерильной дистиллированной обработанной ДЭПК воде и набивают этой целлюлозой одноразовую колонку или шприц (объем упакованной колонки должен быть около 1 мл).
2. Промывают колонку горячей (65 °С) водой и 5 мл 1 х буфера для нанесения.
3. Растворяют образец РНК в 250 мкл воды, прогревают его 5 мин при 65 "С, быстро охлаждают до комнатной температуры и добавляют равный объем 2 х буфера для нанесения.
4. Наносят образец на колонку и сразу собирают элюат.

5. Промывают колонку 1 мл буфера для нанесения и объединяют элюаты.
6. Прогревают суммарный элюат 5 мин при 65 °С, быстро охлаждают до 20 С и повторно наносят его на колонку.
7. Промывают колонку буфером для нанесения (10 раз по 1 мл) для полной элюции poly(A)— РНК.
8. Для элюции poly(A)+-PHK наносят на колонку 1,8 мл горячей (65 °С) воды и сразу собирают элюат.
9. Прогревают элюат 5 мин при 65 °С и быстро охлаждают его до комнатной температуры.

10. Добавляют 0,2 мл 5 М NaCl, наносят смесь на новую колонку и повторяют пп. 4-7.
11.Элюируют poly(A)+-PHK двумя порциями по 1 мл горячей (65 °С) воды.
12. Экстракцией изобутанолом концентрируют элюат до объема примерно 400 мкл.
13.Добавляют к образцу 2,5 объема этанола и хранят при —70 °С. 14.ро1у(А)+-РНК можно получить.

- Читать далее "Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле"