• ТЭ-буфер: 10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0
• Раствор бромистого этидия: 1 мкг/мл в ТЭ

Методика
1. Готовят серию разведений образца ДНК или РНК и соответствующих стандартных растворов в буфере ТЭ и добавляют ко всем разведениям равный объем раствора бромистого этидия.
2. На трансиллюминатор кладут кусочек пластиковой пленки (типа Saran).
3. На пленку наносят по 5 мкл каждого разведения образца и стандартного раствора.
4. Определяют концентрацию образца, сравнивая интенсивности флуоресценции стандартного раствора и разведений. Для облегчения оценки можно сфотографировать пленку.

Хранение нуклеиновых кислот:
• РНК необходимо хранить при -70 С в 70% этаноле,
• Для непродолжительного хранения ДНК достаточно температуры 4 °С, для долговременного более предпочтительна температура —70 С. В то же время повреждение ДНК свободными радикалами может быть сильнее при —70 С.
• ДНК нельзя хранить при -20 "С, поскольку при этой температуре в ней образуется большое число одно- и двухцепочеч-ных разрывов. Разрывы возникают также при замораживании—оттаивании препаратов.

Бактериальные плазмиды

В последующих наших статьях описаны методы очистки рекомбинатных бактериальных плазмид и последующее мечение клонированных вставок—фрагментов ДНК (или их РНК-копий) с использованием различных ферментативных методов. Рассмотрены методы как изотопного, так и неизотопного мечения, проведен их сравнительный анализ.

Бактериальные плазмиды — это двухцепочечные кольцевые замкнутые молекулы ДНК, размер которых варьирует от 1 до 200 т.н. Их репликация и распределение между дочерними клетками не зависит от бактериальной хромосомы, хотя для репликации и транскрипции они используют кодируемые клеткой-хозяином белки и ферменты.

В природных условиях многие плазмиды передаются в новую клетку-хозяина при конъюгации. В лаборатории плазмидную ДНК можно ввести в бактериальную клетку с помощью искусственного процесса трансформации. Для этого клетку обрабатывают смесью двухвалентных катионов, и она временно становится проницаемой для малых молекул ДНК. Для отбора трансформантов используются кодируемые плазмидами селективные маркеры. Чаще всего это гены, которые обеспечивают устойчивость бактерий к антибиотикам, таким как тетрациклин и ампициллин.

За время развития генной инженерии размер плазмидных векторов для клонирования был уменьшен до минимума, с тем чтобы увеличить размер клонируемых фрагментов чужеродной ДНК, полученных с использованием широкого спектра рестриктаз. В настоящее время практически все векторы содержат так называемый «полилинкер», или поликлонируюший сайт — несколько тесно расположенных синтетических уникальных (не присутствующих в других частях вектора) сайтов для клонирования. Например, поликлонируюший сайт в векторе pUC19 состоит из последовательно расположенных сайтов узнавания для 14 рестриктаз. Включение полилинкера в ген, кодирующий биологически активную р-галактозидазу, приводит к тому, что встраивание чужеродной ДНК практически всегда сопровождается инактивацией этого фермента. При этом рекомбинантные клоны теряют способность гидролизовать хромогенный субстрат, 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-В-галактозид (X-gal), и могут быть отобраны из исходных клонов дикого типа с помощью гистохимического недеструктивного теста. Несущие рекомбинантные плазмиды бактерии образуют при этом колонии белого цвета, а исходные бактериальные клоны — голубого (этот процесс был назван а-комплементацией).

Помимо плазмидных векторов, дающих возможность проводить визуальную идентификацию рекомбинантных клонов с помощью гистохимических тестов, были созданы векторы, позволяющие получать одноцепочечные матрицы для секвенирования ДНК (например, векторы типа pUC и pBluescript), транскрибировать чужеродные последовательности ДНК in vitro (например, векторы типа pSP64/65 и его производные, векторы pBluescript/pBluesribe [Stratagene, San Diego, USA]) и синтезировать большие количества чужеродных белков.

- Читать далее "Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами"