В присутствии бромистого этидия различие в плавучей плотности плазмидной и хромосомной ДНК становится еще более значительным. Связываясь с линейной двухцепочечной ДНК, этот краситель встраивается между плоскостями оснований (интеркалирует), вызывает расплетание двойной спирали, увеличивает длину линейных фрагментов хромосомной ДНК и приводит к снижению ее плавучей плотности. В плазмидной ССС-ДНК интеркаляция красителя вызывает образование компенсаторных сверхспиральных витков, и при достаточно большом их числе встраивание следующих молекул бромистого этидия становится невозможным.

При равновесном центрифугировании в градиенте насыщенного раствора хлористого цезия в присутствии бромистого этидия плазмидная ДНК имеет более высокую плавучую плотность, чем хромосомная, и концентрируется в полосе, расположенной ниже, чем полоса хромосомной ДНК. Обычно эта полоса имеет красный цвет и ее не нужно визуализировать в УФ-свете. РНК при центрифугировании осаждается на дне пробирки.

Чтобы отобрать плазмидную ДНК после центрифугирования, пробирку прокалывают сбоку на нужной высоте иглой, надетой на шприц, и отсасывают материал. Обычно препарат плазмидной ДНК после центрифугирования в равновесном градиенте плотности в присутствии красителя содержит очень мало РНК и белков и они не влияют на последующие манипуляции с плазмидной ДНК. При необходимости примеси белков можно удалить экстракцией фенолом/хлороформом, а примеси РНК — центрифугированием или хроматографией. Если провести ультрацентрифугирование не удается, то процедуру вьщеления из больших объемов культуры можно довести до п. 8, а потом до переосаждения этанолом удалить белковые примеси, как это описано в протоколе.

Выделение плазмидной ДНК из небольшого объема бактериальной культуры

Материалы
• Раствор I: 50 мМ глюкоза, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА. Хранить при 4 °С
• Раствор II: 0,2 М NaOH, 1,0% (о/о) ДСН. Раствор можно хранить при комнатной температуре не более недели.
• Раствор III: 60 мл 5 М ацетата аммония, 11,5 мл ледяной уксусной кислоты, 28,5 мл Н20. Полученный в результате раствор является 3 М по ионам аммония и 5 М по ацетат-ионам.
• Раствор IV: 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5.

Методика
1. Одну бактериальную колонию (полученную в результате эксперимента по трансформации, как это описано в протоколе 13.1, или ранее расштрихованную из хранящейся в глицерине бактериальной культуры) вносят в неплотно закрытую пробирку на 15 мл с 2 мл LB-среды, содержащей соответствующий антибиотик. Растят бактериальную культуру при интенсивном встряхивании (200 об/мин) при 37 С в течение ночи до ОД600=1Д
2. Переносят 1,5 мл культуры в микроцентрифужную пробирку и собирают клетки центрифугированием при 12 000 g в течение 1 мин. Оставшуюся культуру хранят при 4 С.
3. Отсасывают супернатант и при интенсивном встряхивании ресуспендируют осадок бактериальных клеток в 100 мкл холодного раствора I. Инкубируют во льду 15 мин.

4. Добавляют 200 мкл раствора II и перемешивают смесь быстрым пятикратным переворачиванием закрытой пробирки без встряхивания. Инкубируют пробирку во льду 5 мин.
5. Добавляют 150 мкл буфера 111, закрывают пробирку и перемешивают содержимое осторожным встряхиванием в течение 10 с. Инкубируют во льду 10 мин.
6. Центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 мин при 4 С и отбирают супернатант в новую пробирку.

7. Для осаждения двухцепочечной ДНК добавляют 1 мл холодного этанола, перемешивают встряхиванием и на 30 мин помещают на —20 С.
8. Центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 мин при 4 С.
9. Осторожно отбирают супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл раствора IV.
10. Добавляют 200 мкл этанола, перемешивают и на 10 мин помещают на —20 °С. Центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 2 мин при 4 °С.

11. Отбирают супернатант, добавляют к осадку 1 мл этанола, центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 2 мин при 4°С.
12. Отбирают супернатант, осадок нуклеиновых кислот подсушивают на воздухе в течение 10 мин. Растворяют нуклеиновые кислоты в 50 мкл ТЭ и хранят при -20 С.
Обычно метод, описанный в протоколе, дает при выделении многокопийных плазмид типа pUC выход 3-5 мкг ДНК на 1 мл исходной бактериальной культуры. Если полученные таким способом мини-препараты ДНК не удается рестрицировать, то для удаления загрязнений можно провести экстракцию фенолом/хлороформом. Пропорционально увеличив количество всех необходимых реактивов, можно использовать данный метод для выделения ДНК из культур объемом до 10 мл.

- Читать далее "Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК"