Выделение высокомолекулярной ДНК и РНК — предварительный этап в большинстве молекулярно-биологических работ. Эффективность этой процедуры не очень важна, когда работают, например, с клеточными культурами: в этом случае количество получаемых нуклеиновых кислот можно увеличить простым увеличением биомассы. Однако проблема эффективности становится весьма существенной, когда исследуются клинические образцы, поскольку при биопсии часто удается получить лишь очень небольшое количество материала, а проводить ее повторно бывает затруднительно. Один из путей решения проблемы малого количества материала — одновременное выделение из ткани как можно большего количества высококачественных ДНК и РНК. Однако для получения высокомолекулярной ДНК необходима щадящая гомогенизация ткани, что препятствует проникновению в клетки ингибиторов нуклеаз и способствует деградации нуклеиновых кислот, особенно РНК. В то же время энергичная гомогенизация клеток приводит к сильному механическому разрушению ДНК. Чтобы минимизировать деградацию РНК при сохранении высокомолекулярной ДНК, замороженный препарат гомогенизируют в присутствии замороженного фенола и потом одновременно расплавляют препарат и фенол. Это обеспечивает тесный контакт между нуклеазами и их инактиваторами и создает оптимальные условия для выделения высокомолекулярной ДНК и интактной РНК с высоким выходом из очень небольших количеств ткани. Детальное описание этого метода приведено в протоколе.

Одновременное выделение высокомолекулярной ДНК и РНК с использованием замороженного фенола

Материалы
Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• Буфер для выделения: 300 мМ ацетат натрия, 50 мМ ЭДТА, рН 7,5. Перед использованием добавляют саркозил до концентрации 0,5% (в/о)
• Саркозил: готовят 10% раствор (в/о) в стерильной дистиллированной воде, прогревают его при 65 °С в течение минимум 1 ч
• Насыщенный буфером фенол
• Смесь хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1, о/о)
• 10хТЭ: 100 мМ трис-НС1, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0
• Раствор хлористого цезия: 1,3 г CsCl на 1мл 10хТЭ (конечная плотность — 1,7 г/мл)
• Бромистый этидий: 10 мг/мл в стерильной дистиллированной воде
• 3 М ацетат натрия, рН 5,2

1. Смешивают в полипропиленовой пробирке на 50 мл 5 мл насыщенного буфером фенола и 5 мл буфера для выделения.
2. Интенсивно гомогенизируют и быстро помещают полученную эмульсию в жидкий азот. Выдерживают ее в азоте до начала замерзания.
3. Охлаждают в сухом льду стакан из нержавеющей стали для гомогенизатора Уоринга (Patterson Scientific).
4. Измельчают в порошок примерно 5 г сухого льда и добавляют немного замороженной смеси фенола с буфером для выделения.
5. Измельчают в порошок смесь фенола с буфером для выделения и добавляют в стакан гомогенизатора еще немного этой смеси.

6. Повторяют измельчение до тех пор, пока вся смесь фенола с буфером для выделения не будет измельчена.
7. Добавляют замороженную ткань к порошку фенол/буфер для выделения и измельчают до порошкообразного состояния. Во время измельчения смесь должна быть полностью заморожена, для чего при необходимости в стакан добавляют сухой лед.
8. Переносят порошкообразную смесь в полипропиленовую пробирку на 50 мл и быстро при осторожном перемешивании плавят смесь фенол/буфер/ткань в водяной бане при 65 °С. При этом крышку пробирки плотно не закрывают. 9. Когда фенол начнет плавиться, осторожно и тщательно перемешивают содержимое пробирки до образования гомогенной эмульсии.
10. После полного расплавления фенола смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин.

11. Центрифугируют образец при 3500 g в течение 1 мин и добавляют 5 мл смеси хлороформа с изоамиловым спиртом.
12. Перемешивают образец со смесью фенол/хлороформ: изоами-ловый спирт в течение 5 мин при комнатной температуре.
13. Разделяют водную и органическую фазы центрифугированием при 3500 g в течение 5 мин при комнатной температуре.
14. Переносят водную фазу и белковую интерфазу в новую пробирку, добавляют равный объем смеси хлороформ : изоамило-вый спирт и перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре.
15. Разделяют фазы центрифугированием при 3500 g в течение 5 мин при комнатной температуре и переносят только водную фазу в новую пробирку.

16. Повторяют п. 15 еще раз.
17. Добавляют на каждый миллилитр полученного тканевого экстракта 0,8 г CsCl.
18. В центрифужную пробирку вносят 3 мл раствора CsCl и аккуратно наслаивают на эту подушку полученный в п. 17 раствор. К тканевому экстракту можно добавить бромистый этидий (до концентрации 25 мкг/мл), чтобы облегчить последующую визуализацию нуклеиновых кислот.
19. Центрифугируют при 135 000 g в течение 24 ч при 25 °С (например, при 32 000 об/мин в роторе SW41).
20. После центрифугирования ДНК образует полосу в верхней части подушки из CsCl, а РНК осаждается на дне пробирки.

21. ДНК отбирают пипеткой с широким наконечником и переносят ее в новую пробирку. Остальной раствор осторожно, чтобы не взмутить осадок РНК, отбирают микропипеткой.
22. Добавляют в пробирку 750 мкл 80% этанола и переносят его вместе с осадком РНК в микроцентрифужную пробирку.
23. Промывают центрифужную пробирку 750 мкл 80% этанола и переносят его в микроцентрифужную пробирку с осадком РНК.
24. К раствору ДНК добавляют равный объем стерильной дистиллированной воды и затем два начальных (или один конечный) объема изопропанола. Осторожно перемешивают для образования осадка ДНК.
25. Осадок ДНК собирают центрифугированием при 3500 g в течение 5 мин при комнатной температуре.

26. Отбирают супернатант и промывают осадок ДНК 2—3 раза 70% этанолом.
27. Высушивают осадок ДНК под вакуумом в течение 2,5 мин и растворяют в ТЭ до концентрации примерно 1 мг/мл.
28. Осадок РНК собирают центрифугированием при 14 000 g в течение 5 мин при комнатной температуре и отбирают супернатант. Промывают осадок 80% этанолом.
29. Растворяют осадок РНК в 300 мкл ТЭ, добавляют 750 мкл абсолютного этанола и хранят образцы под спиртом при -70 С.
30. РНК для дальнейшей работы получают согласно пп. 17—20 протокола 12.5.

- Этим методом удается получить препараты ДНК и РНК достаточно высокого качества, пригодные для Саузерн- и Нозерн-гибридизации. Эффективность экстракции РНК и ДНК определяется скоростью инактивации нуклеаз, поэтому во время плавления фенола образцы должны быть перемешаны с фенолом очень тщательно до образования гомогенной эмульсии.
- На этом этапе ДНК и РНК можно хранить при температуре соответственно 4 С и - 70 °С. Бромистый этидий можно удалить экстракцией изобутанолом.

- Читать далее "Очистка poly(A)+-PHK. Выделение poly(A)+-PHK"