Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• Формальдегид: обычно его поставляют в виде 37% водного раствора. Формальдегид окисляется на воздухе, поэтому его необходимо хранить плотно закрытым. рН концентрированного раствора должен быть выше 4,0. Если рН становится ниже этого значения, формальдегид необходимо заменить
• Формамид: обычно формамид высокой степени чистоты можно использовать в том виде, в каком он поступает от фирмы. Однако если он имеет желтоватый цвет, его необходимо деионизовать с помощью смеси ионообменных смол, как это описано в протоколе.
• 10 х буфер для электрофореза: 0,2 М MOPS, 75 мМ ацетат натрия, 20 мМ ЭДТА, рН 7,0
• Буфер для нанесения: 50% глицерин, 0,25% бромфеноловый синий в 1 х буфере для электрофореза

Методика
1. Готовят 1,6% (в/о) агарозу на обработанной ДЭПК воде и охлаждают раствор до примерно 60 С.
2. Добавляют 1/7 объема 10 х буфера для электрофореза и 1/4 объема формальдегида (37% раствор), тщательно перемешивают. Конечная концентрация агарозы при этом равна примерно 1,1%.
3. Растворяют каждый образец РНК (содержащий примерно 20 мкг РНК) в 3,3 мкл воды и добавляют 1,5 мкл 10 х буфера для электрофореза, 7,5 мкл формамида и 2,7 мкл формальдегида.

4. Денатурируют РНК в течение 15 мин при 65 С и охлаждают ее во льду в течение 5 мин.
5. Добавляют к каждому образцу по 2,5 мкл буфера для нанесения, перемешивают и быстро центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 g.
6. Вносят образцы в лунки агарозного геля и проводят электрофорез при градиенте напряженности 1—3 В/см в 1 х буфере для электрофореза. Через 1-2 ч после начала электрофореза буфер заменяют
7. По окончании электрофореза (когда бромфеноловый синий дойдет до конца геля) окрашивают гель в водном растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) при аккуратном покачивании в течение I ч. При сильном фоновом окрашивании лишний бромистый этидий отмывают водой (две смены по 30 мин каждая).

8. Просматривают гель на УФ-трансиллюминаторе и фотографируют его фотоаппаратом «Поляроид».
- Бромистый этидий (1 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл) можно добавить непосредственно в образцы РНК еще до электрофореза.
- Во время электрофореза в геле, содержащем формальдегид, фрагменты ДНК обычно деградируют. Кроме того, при проведении электрофоре:» в таких условиях молекулы РНК движутся быстрее, чем молекулы ДНК такого же размера. По этим причинам в качестве маркера необходимо использовать РНК, а не ДНК

Количественный анализ нуклеиновых кислот

Для определения концентрации ДНК и РНК в растворе широко используются два метода. Наиболее простым и точным является спектрофотометрический метод, однако он обладает сравнительно малой чувствительностью. Если общее содержание нуклеиновых кислот невелико, то концентрацию ДНК и РНК можно определить по интенсивности их флуоресценции в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.

а. Электрофоретический метод
Для примерной оценки концентрации препаратов ДНК или РНК на гель наносят разные количества маркерных нуклеиновых кислот. Концентрацию исследуемых ДНК или РНК в образце оценивают, сравнивая интенсивность флуоресценции образца и стандартных маркеров с известной концентрацией. При этом важно, чтобы образцы ДНК и РНК сравнивались с соответствующими маркерами, поскольку при одинаковом количестве ДНК и РНК интенсивность их флуоресценции в УФ-свете различается.

б. Метод пятен
Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно определить, окрасив раствор бромистым этидием, измерив интенсивность флуоресценции в УФ-свете и сравнив ее с флуоресценцией маркеров известной концентрации. Как и при электрофоретическом методе, маркеры должны представлять собой нуклеиновые кислоты соответствующего типа (т. е. ДНК или РНК). Этот метод описан в протоколе.

- Читать далее "Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды"