Материалы
• Среда для переноса: 0,02 М фосфатный буфер, рН 7,2, содержащий 0,2 М сахарозу, 10% сыворотку плода коровы, инактивированную нагреванием, гентамицин в концентрации 25 мкг/мл и амфотерицин В в концентрации 2,5 мкг/мл
• Рестрикционный буфер: 50 мМ трис-HCl, рН 8,5, 1 мМ ЭДТА, 1 % (о/о) ДСН, протеиназа К, 200 мкг/мл
• Легкое минеральное масло
• Буфер для ПЦР: 10 мМ трис-HCl, рН 8,3, нагретый до 25 °С, 50 мМ КС1, 2,5 мМ MgCl2, 0,01 % желатина, по 200 мкМ каждого из трифосфатов: dATP, dCTP, dTTP, dGTP

Методика
1. Такие клинические образцы, как мазки шейки матки или уретры, либо пробы мочи, полученные в пределах 24 ч, помещают прямо в среду для переноса. Кал предварительно размельчают в физиологическом растворе, например в ФСБ (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, рН 7,4), так чтобы конечная концентрация составляла 200—250 мг/мл.
2. Осаждают нерастворимые частицы низкоскоростным центрифугированием (200 g, 5 мин). Сливают 0,5 мл светлой надосадочной жидкости и осаждают бактерии центрифугированием при 12 000 g в течение 1 мин. Ресуспендируют осадок в 100 мкл рестрикционного буфера.
3. Встряхивают пробирки на вортексе, чтобы диспергировать осадок, и инкубируют в течение 1 ч при 55 °С.

4. Инактивируют протеиназу К, проинкубировав образцы при 95 °С в течение 10 мин. Кратковременно (2 с) центрифугируют на микроцентрифуге.
5. Маркируют пробирки для ПЦР объемом 0,5 мл (Perkin—Elmer Cetus) и добавляют в каждую из них 75 мкл легкого минерального масла. Затем добавляют по 100 мкл 1 х буфера для ПЦР, содержащего по 0,2 мкМ каждого из праймеров и 2,5 ЕД на 100 мкл ДНК-полимеразы Taq (Amplitaq, Perkin—Elmer Cetus).
6. В каждую из пробирок добавляют по 1-10 мкл образца. Перемешивают и центрифугируют 10 с на микроцентрифуге, чтобы водная фаза оказалась под слоем масла.

7. Помешают пробирки в автоматический термоциклер (например, Perkin—Elmer Cetus, Norwich, Connecticut, USA) и проводят 30-35 циклов амплификации. Каждый цикл включает: денатурацию, 95 "С, 1 мин; отжиг, 55 °С, 30 с; элонгацию, 72 С, 1 мин. В последнем цикле этап элонгации следует продлить дополнительно на 5 мин. Параллельно каждой ПЦР-реакции с участием исследуемой ДНК необходимо проводить аналогичные реакции с положительным и отрицательным контролями, чтобы убедиться в отсутствии ингибиторов реакции или примесей посторонней ДНК.
8. Если ПЦР-продукты нельзя проанализировать сразу же после окончания реакции, то препараты следует держать в циклере при 15 С до начала анализа или хранить при 4 С.
- Для лизиса клеток разных микроорганизмов могут потребоваться разные условия, и иногда для этого приходится добавлять лизоцим. Если после проведения ПЦР с участием самих лизатов никаких ГЩР-продуктов не обнаруживается, то нужно выделить нуклеиновые кислоты смесью этанол/хлороформ и осадить их этанолом.
- Концентрацию ионов магния, праймеров, ДНК-полимеразы Taq и дезокситрифосфатов для каждой системы нужно подбирать индивидуально, но в большинстве случаев вполне пригодны указанные значения. Было показано, что эти условия обеспечивают амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени в позитивных клинических образцах.

ПЦР-продукты можно анализировать несколькими способами. Их можно зафиксировать на твердой подложке (фильтре) и гибридизовать с мечеными зондами или провести гибридизацию в растворе, а затем гель-электрофорез и радиоавтографию. Амплифицированную нуклеиновую кислоту-мишень часто удается обнаружить непосредственно в агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Однако применение ДНК-зондов обеспечивает ббльшую специфичность и чувствительность. В протоколе описан быстрый метод анализа ПЦР-продуктов с помощью дот-блот-гибридизации с 32Р-зондами.
При этом предполагается использование специального прибора для изготовления дот-блотов, однако образцы можно наносить на фильтры и вручную.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."