Миллионы людей в развивающихся странах ежегодно погибают от кишечных инфекций, сопровождающихся диареей. Возбудителями таких инфекций могут быть различные вирусы и бактерии, и их точная идентификация очень важна для назначения правильного лечения. Некоторые кишечные патогенные микроорганизмы, например продуцирующие энтеротоксин Escherichia coli, вызывают гиперсекрецию в клетках кишечного эпителия.

Другие патогенные бактерии, например некоторые виды Shigella, вызывают бактериальную дизентерию, разрушая эпителиальные клетки толстой кишки. Обычно патогенные организмы идентифицируют с помощью посева кала больного и последующего биохимического и иммунологического анализа. Патогенные и непатогенные штаммы Е. coli дифференцируют с помощью специфических антисывороток и культуральных методов с постановкой теста на токсичность.

Если же использовать для обнаружения этих патогенов молекулярные методы, проводя гибридизацию на культурах, выращенных в селективной среде, или непосредственно на образцах кала, то время и стоимость анализа можно резко снизить.

В протоколе описана процедура переноса колоний с селективной среды на найлоновые и нитроцеллюлозные фильтры, последующий лизис клеток и фиксация высвободившейся ДНК на фильтрах. Она представляет собой модификацию метода, представленного в работе.

Перенос колоний с селективной среды на твердую подложку

Материалы
• 10%ДСН
• Раствор для денатурации: 0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl
• Буфер для нейтрализации: 0,5 М трис-HQ, рН 8,0, 1,5 М NaCl

Методика
1. Переносят образец кала или ректального мазка на чашки с агаром Макконки и Гектена. Переворачивают чашки и инкубируют их при 37 С в течение 12—24 ч., периодически проверяя рост колоний.
2. Помещают на поверхность питательного агара найлоновый или нитроцеллюлозный фильтр диаметром 82 мм (работают в перчатках).
3. Переносят колонии с селективной среды на фильтр, пользуясь стерильной зубочисткой или петлей для пересева. При переносе на фильтр делают небольшие штрихи, стараясь размещать колонии по отдельности.

4. Отдельно на тот же фильтр переносят колонии позитивных и негативных (нетоксичных) контрольных клеток из ночных культур. Тщательно маркируют эти штаммы на фильтре с помощью несмываемых чернил или отверстий, проделанных в фильтре иглой N° 20. Позитивные контрольные клетки содержат нуклеотидную последовательность, к которой специфичен используемый зонд (фрагмент гена, кодирующего токсин), в негативных контрольных клетках эта последовательность отсутствует.
5. Переворачивают чашки и инкубируют их при 37 "С в течение 12 ч.
6. С помощью пинцета с тупыми концами снимают фильтр с агара и кладут его на 3—4 листа фильтровальной бумаги (ватман 3 ММ), предварительно вымоченных в 10% ДСН в течение 5 мин (фильтр должен быть обращен вверх стороной, на которую нанесены колонии).
7. Удаляют с фильтра избыток жидкости, промокнув бумагой, и переносят его на вторую стопку фильтровальной бумаги ватман 3 ММ, вымоченной в течение 5 мин в растворе для денатурации.

8. Переносят фильтр на бумагу ватман 3 ММ, вымоченную в течение 5 мин в буфере для нейтрализации.
9. Переносят фильтр на сухой лист ватмана 3 ММ и высушивают его при комнатной температуре или при 37 °С в течение 30-60 мин.
10. Помещают фильтр между двумя листами ватмана 3 ММ и кладут эту стопку между двумя стеклянными пластинами. Выдерживают в вакуумном термостате при 80 С в течение 2 ч. Чтобы фискировать денатурированную нуклеиновую кислоту на фильтре, помещают его на несколько минут под УФ-свет (например, лампы Stratalinker, Stratagene, Inc.). По нашим данным, этот метод дает хорошие результаты при работе с заряженными найловыми фильтрами, но не с нитроцеллюлозными. Фильтры можно использовать для гибридизации сразу же или хранить завернутыми в алюминиевую фольгу под вакуумом при комнатной температуре.

- Для выявления патогенных микроорганизмов можно использовать сами образцы кала (впрочем, этот метод менее чувствителен). В этом случае помещают небольшое количество образца на найлоновый или нитроцеллюлозный фильтр и кладут фильтр на питательный агар. После инкубации при 37 °С в течение 24 ч колонии готовят к гибридизации.
- Приготовление чашек с селективной и неселективной средами описано в работе.

- Читать далее "Гибридизация нуклеиновых кислот иммобилизованных на фильтрах с ДНК-зондами. Техника гибридизации с ДНК зондами"