Условия, при которых гибридизация протекает оптимальным образом, зависят от свойств зонда: короткий он или длинный, одно- или двухцепочечный и т. д. Способы детекции гибридизовавшегося зонда также различаются и зависят от типа молекул-свидетелей, связанных с зондом. Все эти вопросы подробно рассматриваются в многочисленных обзорах. В протоколе описана процедура гибридизации с короткими олигонуклеотидными зондами, к которым ковалентно пришита щелочная фосфатаза.

Такие зонды можно приготовить способом, описанным в работе, или получить в готовом виде в составе наборов (поставляемых, например, фирмой Cambridge Research Biochemicals, UK).

Материалы
• Предгибридизационный буфер: 5 х SSC, 1% (о/о) ДСН, 0,5% (в/о) БСА, 0,5% (в/о) поливинилпирролидон
• 20 х SSC: 3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0
• Буфер для промывания: 0,1 М трис-HCl, рН 8,5
• Нитросиний тетразолий (НСТ): маточный раствор (75 мг/мл) в 70% диметилформамиде (ДМФ)
• 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (БХИФ): маточный раствор (50 мг/мл) в ДМФ
• Субстратный буфер: 0,1 М трис-HCl, 0,1 М NaCl, 50 мМ MgCI2, рН8,5

Методика
1. Помещают фильтры с фиксированными на них нуклеиновыми кислотами-мишенями в пластиковые мешочки, запаивают их и инкубируют фильтры в предгибридизационном буфере при 50 С 15 мин. Используют такое количество буфера, чтобы он покрывал свободно плавающий фильтр (примерно 100—200 мкл/см2).
2. Срезают угол мешочка и сливают буфер. Добавляют порцию свежего буфера, содержащего 50 нг ДНК-зонда, меченного ЩФ, Вновь используют такой объем гибридизационного буфера, чтобы он покрывал фильтр. Запаивают мешочек и инкубируют фильтр при 50 °С 15-30 мин.
3. Промывают фильтры в двух сменах по 10 мл смеси 1 х SSC и 1 % ДСН при 50 °С, по 5 мин в каждой смене.

4. Промывают фильтры в 1 х SSC без детергента в течение 5 мин (ДСН и другие детергенты могут помешать осаждению красителя).
5. Окрашивают фильтры в растворе, содержащем 0,33 мг/мл НСТ, 0,17 мг/мл БХИФ в буфере для субстрата, при комнатной температуре до полного окрашивания (обычно этот процесс занимает 1 ч).

После окрашивания те места на фильтре, где локализованы колонии, окрашиваются в пурпурный цвет. Чтобы различить действительно позитивные образцы от негативных, сравнивают окрашивание нанесенных на этот же фильтр негативных и позитивных контрольных колоний. Обычно наблюдается небольшое фоновое окрашивание, которое можно отличить от слабого окрашивания позитивных образцов, сравнив его с окрашиванием негативных контрольных колоний.

Возможность быстрой диагностики инфекционных заболеваний путем прямого скрининга ограничивается отсутствием достаточно чувствительных методов детекции. Молекулярно-биологические методы, основанные на использовании для обнаружения патогенных микроорганизмов специфических зондов, имеют ряд преимуществ перед классическими методами культивирования in vitro с последующим биохимическим и серологическим тестированием.

Однако, хотя они и не требуют применения биохимических и иммунологических методов, их чувствительности тоже недостаточно для прямой идентификации микроорганизмов в таких сложных клинических образцах, как кал или моча. Чувствительности и специфичности, необходимых для обнаружения экзогенных нуклеотидных последовательностей непосредственно в клинических образцах, можно достичь, если перед гибридизацией с зондами провести ПНР-амплификацию. Это позволяет получить за несколько часов миллионы копий искомой последовательности-мишени.

С помощью ПЦР можно амплифицировать и обнаружить всего одну молекулу ДНК на фоне огромного числа молекул геномной ДНК, присутствующих в образце. Имеются данные об обнаружении патогенных микроорганизмов с помощью ПЦР и последующей гибридизации непосредственно в клинических образцах; одна из таких методик описана в протоколе.

- Читать далее "Применение ПЦР для обнаружения патогенных микроорганизмов. Техника выявления микроорганизмов методами ПЦР"