Методы FISH-диагностики в генетике. Метод гибридизации in situ в кариотипировании

Методы FISH-диагностики стали широко использовать для исследования хромосомных аномалий в интерфазных ядрах, что особенно важно с практической точки зрения, так как метод экономичен и занимает мало времени. В норме, если например у пациента или плода есть дисомия по 21-й хромосоме, к ядре будут видны две флюоресцирующие цветные точки. При наличии трисомии хромосомы 21 (синдром Дауна) будут видны три точки.

Методы молекулярной цитогенетики позволили повысить верифицикацию хромосомных болезней. При использовании обычных цитогенетических анализов - доля невыявленных случаев составила 10 %, при использовании FISH-технологии - снизилась до 0,9-1,5 %.

Исследования хромосомных синдромов базируются на основе использования различных типов ДНК-зондов, позволяющих маркировать (метить) индивидуальные хромосомы или их участки.

Для успешного практического использования этих методов созданы специальные библиотеки хромосомоспецифичных участков ДНК. ДНК-зонды в последние годы метят различными цветами (цветные FISH-технологии), что позволяет не только повысить качество анализа и проанализировать количественные и структурные перестройки хромосом, но и осуществлять экспресс-диагностику, что особенно важно для пренатальной диагностики.
Метод гибридизации in situ модифицирован и разработан в отделе генетики научного центра психического здоровья РАМН.

Методика проведения молекулярно-цитогенетической диагностики включает: вначале ДНК пробу метят тритием (3Н). Затем пробу денатурируют прогреванием в течение 5 мин при 100 °С в 20 мкл гибридизационной смеси, содержащей 2XSSC, 50 % формамидаДО % декстрансульфата - 500 и 1-3хЮ5 -имп/мин радиоактивной ДНК. Хромосомную ДНК на предметном стекле также денатурируют в растворе 0,07 М NaOH в течение 30 сек с последующим промыванием препаратов в 70"(2 раза) и 96°(2 раза) этаноле в течение 5 мин. Гибридизацию проводят за 18 часов при 37 "С, после чего следует промывание препаратов в 2 сменах 2XSSC, 50 % формамида при 39 "С в течение 5 мин; 2 сменах 2XSSC при комнатной температуре; 2 сменах 70" и 96° этанола с течение 5 мин. Высушивают препараты на воздухе с последующим покрытием эмульсией типа М. Экспозиция препаратов под эмульсией в среднем 6 дней (от 2 до 12 дней). После этого хромосомные препараты проявляют в амидовом проявителе и окрашивают 30 % раствором красителя Райта в 0,02М фосфатном буфере при рН= 6,8 с контрастированием рисунка Q-сегментации хромосом по методу Чандлера и Юниса. Анализируют радиоавтографы и фотографируют на любом оптическом микроскопе с объективом 100/1.32 при общем увеличении х1125.

Схема молекулярной цитогенетической диагностики

При этом используются хромоспецифичные ДНК-пробы практически на все хромосомы человека (точнее на участки их околоцентромерного гетерохроматина).

Данные пробы применяются с целью:
1) анализа происхождения добавочных маркерных или мини-хромосом (выявление генетического состава);
2) определения сложного хромосомного мозаицизма, когда у больного имеется небольшой процент аномальных клеток;
3) идентификации хромосом, вовлеченных в сложные хромосомные нарушения;
4) уточнения точек разрыва аномальных хромосом.

Эти методы используются при диагностике синдромов Клайнфельтера (кариотип полной формы 47.XXY), Шерешевского-Тернера (45,Х), дисомии Y (47.XYY), трисомии X (47.ХХХ).
За последние годы появились и коммерческие наборы ДНК-проб, которые в готовом виде могут применяться с диагностическими целями.
В использовании молекулярно-цитогенетической диагностики могут нуждаться до 30 % случаев хромосомной патологии.

- Читать далее "Показания для молекулярно-цитогенетического анализа. Принципы молекулярно-генетической диагностики"

Оглавление темы "Методы диагностики в генетике. Информационные базы данных":
1. Молекулярно-цитогенетические методы диагностики. ДНК-зонды в генетике
2. Методы FISH-диагностики в генетике. Метод гибридизации in situ в кариотипировании
3. Показания для молекулярно-цитогенетического анализа. Принципы молекулярно-генетической диагностики
4. Прямые методы ДНК-диагностики. Косвенные методы ДНК-диагностики
5. Функциональная диагностика в генетике. Функциональная диагностика мукополисахаридозов
6. Виды функциональной диагностики в генетике. Фармакологические пробы в генетике
7. Оценка гипермобильности суставов. Пример применения функциаональной диагностики в генетике
8. Проблемы изучения наследственной патологии. Компьютерные справочные системы в генетике
9. Компьютерная диагностика в генетике. Компьютерный дифференциальный генетический диагноз
10. Генетические информационные базы данных. Цели и задачи генетических баз данных

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: