Выделение эмбриональных стволовых клеток. Среды размножения стволовых клеток

В Национальном институте здоровья США на основании обобщения существующих сведений о методах выделения линий ЭСК человека из бластоцисты было сделано предварительное заключение о том, что успешное выделение ЭСК наиболее вероятно при культивировании бластоцист с хорошо сформированной внутренней клеточной массой (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

С этой точки зрения, оптимальным источником ЭСК для создания линий являются бластоцисты человека 5-го дня развития, из которых при выделении внутренней клеточной массы следует тщательно удалять трофэктодерму. Изолированную внутреннюю клеточную массу, состоящую на этой стадии из 30-35 клеток, необходимо культивировать на подложке эмбриональных мышиных фибробластов, что является решающим условием для образования в культуре колоний ЭСК.

Сохранение плюрипотентности и стабильности генома линий ЭСК достигается только при соблюдении достаточно жестких условий их культивирования. После выделения бластоцисты клетки внутренней клеточной массы или изолированный эпи-бласт необходимо выращивать на фидерном слое эмбриональных фибробластов, пролиферация которых блокируется добавлением митомицина С или ионизирующей радиацией.

Фидерный слой стромальных клеток обеспечивает ЭСК мезенхимальную поддержку для выживания, блокировки апоптоза и пролиферации в культуре посредством продукции цитокинов и факторов роста, прямого контакта ЭСК с адгезивной подложкой, необходимого для формирования цитоскелета, а также путем создания иммунного барьера.

эмбриональные стволовые клетки

Совершенно обязательным является присутствие в среде культивирования LIF. Для сохранения стабильности генома ЭСК и наиболее ранних прогениторных клеток, локализованных в ядре клона, в среду необходимо добавлять LIF, SCF и IL-6, а пролиферация более продвинутых периферических популяций требует присутствия FGF, EGF, TGF-a и других митогенов.

Поэтому для размножения ЭСК проводится весьма трудоемкая процедура диспергирования эмбриональных телец с выделением из ядра клона истинных ЭСК. Фактически все линии ЭСК из бластоцисты, длительно сохраняющие нормальный кариотип и высокую активность теломеразы, были получены из разных клонов. При этом гетерогенность ЭСК в разных клонах одного вида или в клонах разных видов остается практически не изученной (Репин, 2001).

В качестве одного из вариантов кондиционной среды для размножения ЭСК мышей можно использовать среду DMEM, состав которой расширен добавлением LIF, эмбриональной телячьей сыворотки, аминокислот, нуклеозидов и меркаптоэтанола (Nichols, 2001). При этом внешний сигнал LIF в синергизме с белками-сайленсерами Oct3/Oct4 удерживает геном пролиферирующих ЭСК в тотипотентном состоянии.

Установлено, что у мышей Oct4 экспрессирован только во внутренней клеточной массе бластоцисты, однако его экспрессия активирует ген, контролирующий синтез FGF4 в клетках трофобласта. Интересно, что двойной нокаут гена oct4 приводит к элиминации герменативного эпителия, в результате чего у мышей oct4 отсутствуют клоны первичных половых клеток. Считается, что особенности ультраструктуры ЭСК отражают их способность к плюрипотентной дифференцировке: крупное, занимающее большую часть клетки ядро характерно для делящихся недифференцированных клеток.

ЭСК мышей линии R1, рост которых в недифференцированном состоянии поддерживается в культуре на стромальном фидере, формируют многослойные колонии с быстро увеличивающимися размерами вследствие высокой скорости деления этих клеток (Мануйлова и др., 2001).

- Читать далее "Функциональная роль LIF. Влияние LIF на ткани"

Оглавление темы "Культура эмбриональных стволовых клеток":
1. Техника культивирования эмбриоидных телец. Гибридные клетки
2. Стволовые клетки из трофобласта. Выделение линий эмбриональных стволовых клеток
3. Техника получения линий стволовых клеток. Селекция чистой популяции стволовых клеток
4. Выделение линий первичных половых клеток. Пролиферация первичных половых клеток
5. Выделение эмбриональных стволовых клеток. Среды размножения стволовых клеток
6. Функциональная роль LIF. Влияние LIF на ткани
7. Влияние LIF на эмбрионы. Фенотипические особенности эмбриональных стволовых клеток
8. Пролиферация эмбриональных стволовых клеток. Клональный рост эмбриональных стволовых клеток
9. Состав клона эмбриональных клеток. Плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток
10. Регенеративные возможности эмбриональных стволовых клеток. Генные маркеры клеток зародышевых листков

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: