Пролиферация эмбриональных стволовых клеток. Клональный рост эмбриональных стволовых клеток

В отличие от нормального эмбриогенеза in vivo, пролиферация ЭСК in vitro не сопровождается образованием зародышевых листков и протекает на фоне блокировки гомеозисных Hox-генов, то есть, без органогенеза. Поскольку гены сегментации не функционируют, в культуре ЭСК невозможно воспроизвести такие периоды эмбриогенеза, как закладка сомитов, сегментация зародыша, формирование желточного мешка, аллантоиса и других провизорных органов и тканей.

Культуральные стволовые клетки как бы застыли в начале процесса образования 350 рестрикциопных линий специализированных клеток. Таким образом, клон дочерних прогениторных клеток и центрально локализованная ЭСК представляют собой лишь модель эмбриона, в процессе развития которого в разных тканевых регионах одномоментно формируются разные линии специализированных клеток, происходящих, тем не менее, из общих предшественников. Несмотря на минимальный уровень рецепторов на поверхности ЭСК, они сохраняют способность осуществлять примитивные формообразовательные процессы, имитируя объемные структуры раннего зародыша: взвесь ЭСК в культуре агрегирует и образует структуры, напоминающие бластоцисты или даже более поздние зародыши (яйцевые цилиндры). Такие суспензионные агрегаты соответственно получили название простых и сложных эмбриоидных телец (Дыбан П., 1979, 2000).

При смешанной дифференцировке в разных клетках одного эмбриоидного тельца одновременно экспрессируются ранние гены эктодермы (oct3, fgf-5, nodal), энтодермы (gata-4), мезодермы (brachyury), кардиогенной мезодермы (пкх-2,5), нейральной трубки (msx3) и кроветворения (elkf). С помощью различных комбинаций ростовых факторов и цитокинов для направленного воздействия на формирование клеток зародышевых листков in vitro в ряде случаев удалось получить эмбриоидные тельца, в которых предпочтительно были экспрессированы гены эктодермы или мезодермы, что открывает путь к моделированию гаструляции и начальных фаз органогенеза.

эмбриональные стволовые клетки

Клональный рост стволовых клеток является свидетельством асимметричного деления клеток, при котором лишь одна из ЭСК в центре клона сохраняет нелимитированный потенциал размножения, в то время как вторая дочерняя клетка порождает поколение прогениторных клеток, уже выходящих в дифференцировку. Поэтому скорость размножения клона на периферии эмбриоидного тельца выше, чем в центре. Краевые клетки растущего клона подвергаются спонтанной неупорядоченной дифференцировке, мигрируют или погибают по механизмам апоптоза.

Эти события определяют судьбу клона: если скорость пролиферации превышает скорость миграции и апоптотической гибели клеток, размеры клона продолжают увеличиваться, стабилизация наступает при равенстве скорости апоптоза и скорости образования новых клеток, регресс — при обратном соотношении этих процессов. Прогениторные клетки делятся симметрично, то есть, обе дочерние клетки в дальнейшем дифференцируются в зрелые специализированные клеточные линии. Соотношение ЭСК/прогениторные клетки варьирует, однако всегда количество ЭСК составляет лишь доли процента от популяции прогениторных клеток. Поэтому только тщательное пипетирование и своевременная дезагрегация клонов способны увеличить число ЭСК в культуре.

Для получения максимального выхода ЭСК наиболее эффективной оказалась дезагрегация клонов на стадии 10-12 клеток. Направление и степень дифференцировки клеток в эмбриоидном тельце зависят от их расположения. Наружные клетки эмбриоидного тельца не экспрессируют ген oct4 и подвергаются дифференциации в клетки первичной энтодермы, из которых в дальнейшем образуются эпителиоподобные клетки париетальной и висцеральной внезародышевой энтодермы. Внутренние клетки эмбриоидного тельца экспрессируют ген oct4 и сохраняют плюрипотентность в течение 48 часов культивирования. Однако затем происходит морфологическая перестройка культуры в эпителиальный монослой и начинается экспрессия генов, контролирующих развитие первичной эктодермы. Далее начинается процесс тотальной неупорядоченной цитодифференцировки с появлением различных клеточных типов, являющихся производными всех трех зародышевых листков.

В процессе спонтанной дифференцировки клеток эмбриоидного тельца первыми возникают агрегаты с маркерами энтодермы в виде фрагментов (цист) желточного мешка. Далее в этих структурах появляются ангиобласты и клетки эндотелия растущих капилляров. На завершающих этапах спонтанной дифференцировки из внутренних клеток эмбриоидного тельца развиваются разнообразные терминально дифференцированные клетки, включая нейроны, глиальные элементы, кардиомиоциты, макрофаги и эритроциты. В определенном приближении (учитывая пространственную инверсию формирования листков зародышевой ткани), с помощью эмбриоидных телец можно in vitro исследовать морфогенетические процессы и анализировать молекулярные механизмы начальных периодов эмбриональной цитодифференцировки, а также установить роль конкретных генов в реализации этих процессов (RathjenJ., Rathjen P., 2001).

- Читать далее "Состав клона эмбриональных клеток. Плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток"

Оглавление темы "Культура эмбриональных стволовых клеток":
1. Техника культивирования эмбриоидных телец. Гибридные клетки
2. Стволовые клетки из трофобласта. Выделение линий эмбриональных стволовых клеток
3. Техника получения линий стволовых клеток. Селекция чистой популяции стволовых клеток
4. Выделение линий первичных половых клеток. Пролиферация первичных половых клеток
5. Выделение эмбриональных стволовых клеток. Среды размножения стволовых клеток
6. Функциональная роль LIF. Влияние LIF на ткани
7. Влияние LIF на эмбрионы. Фенотипические особенности эмбриональных стволовых клеток
8. Пролиферация эмбриональных стволовых клеток. Клональный рост эмбриональных стволовых клеток
9. Состав клона эмбриональных клеток. Плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток
10. Регенеративные возможности эмбриональных стволовых клеток. Генные маркеры клеток зародышевых листков

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: