Иммунохимическое изучение антигенного комплекса. Антигены рака молочной железы

Иммунохимическое изучение антигенного комплекса. Антигены рака молочной железы

Анализ выделенного комплекса был проведен нами совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов и гликопротеипов Института биоорганической химии.
Углеводы в полученных препаратах определяли методом газожидкостной хроматографии в виде триметилсилильных производных метилгликозидов, образующихся после метанолиза (0,5 N НС1 в абсолютном метаноле, 100°С, 24 часа). В качестве внутреннего стандарта использовали D-маннит. Образцы анализировали на газовом хроматографе фирмы «Хыолет Паккард 5710 А» с пламенноионизированным детектором. Условия разделения: газ-носитель-азот, колонки 3 м/2,2 мм, стационарная фаза 1,5% SE — 30 и 1% ХЕ-30 на супелкопоре (100—200 меш), температура испарения и детектора 250°С. После ввода пробы колонка выдерживалась 10 минут при 140°С в изотермическом режиме, затем температура повышалась до 220°С со скоростью 1С/мин. Далее колонка выдерживалась в изотермическом режиме.

Сиаловые кислоты определяли по методу Уоррена.
Белок исследовали по Лоури, а также спектрофотометрически при 280 им, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Нуклеиновые кислоты определяли спектрофотометрически при 260 им.
Гель-хроматографию антигенного комплекса проводили на ссфарозе 4В (колонка 3X40 см) в 0,05 М натрийфосфатпом буфере, рН 6,0, содержащем 0,075 М NaCl и 0,1% азида натрия. Фракции собирали по 10 мл; фракции, содержащие идентичные вещества, объединяли, диализовали и лиофилизовали.

Электрофорез осуществляли в тонком слое 5 % -го полиакриламидного геля с 0,1% SDS в натрийфосфатпом буфере, рН 7,1, на пластинках 12,5X26 см на приборе «Мультифор» фирмы ЛКБ (Швеция). Образцы предварительно инкубировали в буфере с 1% 2-меркаптоэтанола и 1% SDS 2—3 мин при 100°С. На пластинку наносили по 10—50 мкг вещества. Белок проявляли раствором кумасси, углеводы — реактивом Шиффа. Для определения молекулярного веса использовали стандарты, коммерческие препараты фирмы Берингер (ФРГ): трипсиновый ингибитор (21500), РНК-полимеразу (р 165000, |3155000, а 390000), бычий сывороточный альбумин.

Десиалирование антигенного комплекса проводили 0,1 N H2S04 при 80°С в течение 1 часа, раствор охлаждали, диализовали и лиофилизовали.

Проназный гидролиз. 3 мг антигенного комплекса инкубировали в 3 мл трис-HCl буфера, рН 7,5, с 1,2 мг пропазы в течение суток при 37°С. Добавляли еще 1,2 мг проназы и продолжали инкубировать сутки. Далее реакционную массу нейтрализовали и упаривали досуха. Проназу фирмы «Calbiochem» (США) предварительно инкубировали 3 часа в тех же условиях.
Иммунологическое изучение антигенного комплекса было начато с получения иммунных сывороток.

Антисыворотку к антигенам опухоли молочной железы получали путем иммунизации кроликов. Животных иммунизировали многократным введением полученного стерильного антигенного препарата: первоначально в лимфоузлы подколенной области, затем внутрикожно, внутримышечно и подкожно с применением полного адъюванта Фрейнда. Весь период иммунизации длился три месяца и состоял из трех циклов.
Для удаления антител к групповым антигенам крови антисыворотку последовательно адсорбировали смесью сухой плазмы доноров I, II, III групп крови из расчета 5 мг на 1 мл сыворотки.

Противотканевые тела из иммунных сывороток адсорбировали аналогичными антигенными комплексами, полученными из нормальных органов: печени, селезенки, легких, почек, мочевого пузыря, ткани молочной железы.
Адсорбцию проводили порошком антигенного комплекса из расчета 5—25 мг/мл сыворотки. В некоторых случаях использовали адсорбцию в геле, предложенную Бьсрклеидом. После адсорбции иммунную сыворотку проверяли на полноту истощения ( с более концентрированными антигенами).

Выделение глобулиновой фракции из истощенной и концентрированной сыворотки осуществляли осаждением сульфатом аммония при 50% насыщения.
Изучение антигенной активности и выяснение наличия специфичности выделенного комплекса проводили с помощью реакции преципитации в геле методом двойной диффузии по Оухтерлопп с использованием гетерологичных кроличьих сывороток.

Испытание антисыворотки к антигенному комплексу из ткани опухоли молочной железы проводили в тест-системе с образцами опухоли молочной железы и нормальных тканей печени, селезенки, почки и молочной железы. В тест-системе использованы аналогично приготовленные из тканей нормальных органов антигенные комплексы.

Выяснение наличия специфичности антигена проводили ингибицией реакции преципитации тест-системы, взятой в максимально пороговом разведении с другими антигенами, а также испытанием антнсыпороткн к антигену рака молочной железы с концентрированными антигенами. Титр систем составил 1 : 64— 1 : 128.
Материалом исследования служили 19 образцов раковой ткани молочной железы человека и 8 образцов нормальной и опухолевых тканей различных локализаций.

Применение горячей водно-фенольной экстракции (способ I) позволило выделить фракцию, составлявшую 0,1—0.2% от веса исходной высушенной ткани, а после очистки выход ее снижался до 0,01—0,03%. Эти данные согласуются с данными авторов, использующих указанный метод экстракции антигенного комплекса из опухолей других локализаций.

- Читать далее "Экстракция антигенов из рака молочной железы. Углеводы антигенов рака молочной железы"

Оглавление темы "Антигены и антитела при раке":