Выявление генов ответственных за заболевание

В выявлении молекулярной основы наследственного заболевания кожи есть два ключевых этапа. Во-первых, должен быть найден ген, связанный с конкретным заболеванием, во-вторых, в этом гене должна быть выявлена патогенная мутация. Заболевание может быть отнесено к патологии определенного гена либо путем анализа генетической связи, либо кандидатным методом.

Изучение генетической связи включает анализ родословной больных и здоровых людей и выявление, какой именно участок генома специфично связан с фенотипом болезни. Целью является выявление участка генома, который есть у всех больных и которого нет у здоровых людей; этот участок, скорее всего, находится в гене, вызывающем заболевание, также как, возможно, в других непатогенных соседствующих генах, которые наследовались путем неравновесной передачи.

Традиционно в методах связи в масштабах генома используют микросателлитные маркеры разных размеров, разбросанные по всему геному, однако при рецессивных заболеваниях, которыми страдают кровные родственники на протяжении нескольких поколений, более быстрым может быть проведение гомозиготного картирования с помощью чипов единичного нуклеотидного полиморфизма (SNP). Напротив, при кандидатном методе сначала ищут указание на определенный ген путем нахождения специфической для болезни аномалии, например, в экспрессии (или ее недостатке) определенного белка или РНК, либо ультраструктурных или биохимических отличиях между тканями, подверженными болезни, и контрольными тканями. Как бы то ни было, нахождение генетической связи и кандидатный метод не исключают друг друга, а часто используются совместно.

Например, чтобы определить ген, ответственный за такое аутосомно-рецессивное заболевание как липоидный протеиноз, был впервые применен метод определения сцепления генов с использованием микросателлитной ДНК для выявлении группы сцепления генов в участке 1q21, содержащей 68 генов. Предполагаемый ген, вызывающий это расстройство, ЕСМ1 кодирует внеклеточный матриксный белок-1, был идентифицирован кандидатным генетическим методом путем поиска уменьшения генной экспрессии (отсутствие ДНК, комплементарной ДНК фибробластов) во всех этих генах. Уменьшение экспрессии гена ЕСМ1 при липоидном протеинозе по сравнению с контролем дало ключ к гену-кандидату, т.к. в других паттернах экспрессии генов не различались. Ультраструктурный и иммуногистохимический анализ также могут расширить понимание генетической патологии, лежащей в основе развития кожных заболеваний.

Например, снижение количества внутриклеточных бляшек гемидесмосом, регистрируемое путем трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии, и полное отсутствие в дермо-эпидермальном соединении буллезного пемфигоидного антигена 230-kDS (ВР230), выявляемое при иммуном окрашивании, привело к открытию мутации с потерей функции в гене дистонина (DST), кодирующего ВР230 как фактора развития новой формы аутосомального рецессивного простого буллезного эпидермолиза.

Генетика нейрофиброматоза 2 типа

Следующей после идентификации предполагаемого гена наследственного заболевания стадией исследования является выявление патогенных мутаций. Это можно сделать путем полного секвенирования гена, т.к. технический прогресс позволил автоматически определять нуклеотидную последовательность быстрее, дешевле и доступнее. Тем не менее из-за большого размера некоторых генов их полное секвенирование может оказаться непрактичным, и поэтому в качестве первого шага для идентификации области (локуса) гена, который содержит мутацию, может потребоваться первоначальный скрининг.

Существует множество методик выявления мутаций, способных выявлять изменения последовательности клеточной РНК или геномной ДНК, среди которых можно выделить электрофорез в градиенте денатурирующего геля, химическую очистку от ошибочных пар нуклеиновых оснований, метод одноцепочечного конформационного полиморфизма, гетеродуплексный анализ, конформационно чувствительный гель-электрофорез, денатурирующую высокоэффективную жидкостную хроматографию и тест на укороченный белок. Наиболее значимый фактор, который определяет успех любого скрининга генов — это чувствительность используемого метода.

Кроме того, при выборе стратегии мутационного скрининга с использованием геномной ДНК необходимо учитывать размер гена и число экзонов. Чувствительность этих методов значительно меняется в зависимости от размера образца, подвергающегося скринингу. Например, чувствительность метода одноцепочечного комформационного полиморфизма выше 95% для фрагмента из 155 н.п., но уменьшается до 3% при размере фрагмента 600 н.п. Однажды оптимизированная, чувствительность электрофореза в градиенте денатурирующего геля достигает 99% для фрагмента до 500 н.п., а чувствительность конформационно-чувствительного гель-электрофореза составляет от 80 до 90% для фрагмента длиной до 600 н.п. С другой стороны, химическая очистка от ошибочно спаренных оснований имеет чувствительность 95-100% для фрагмента размером более 1,5 килобаз (кб) и идеальна для скрининга компактных генов, где вместе амплифицируется более чем один экзон с использованием геномной ДНК в качестве матрицы.

Все эти методы определяют изменения последовательности, такие как усечение и бессмысленные мутации, а также полиморфизм; как бы то ни было, тест на укороченный белок выявляет только укорачивающие мутации, его чувствительность составляет более 95%, он может использоваться для РНК или ДНК фрагментов свыше 3 кб.

Какой бы метод ни использовался при нахождении разницы между ДНК пациента и контрольным образцом, на следующем этапе необходимо определить распределение этих изменений внутри семьи пациента и установить, является ли это изменение патогенным. С внедрением методов «секвенирования нового поколения» (СНП) в технологииях секвенирования ДНК был достигнут внушительный прогресс. Теперь при помощи СНП стало возможным производить секвенирование полного экзома человека,— т.е. секвенирование всех экзомов генома, кодирующих синтез белков,— за считаные дни, причем стоимость такой процедуры составляет не более нескольких тысяч долларов. Ожидается, что уже в течение 2-3 лет стоимость полногеномного секвенирования не будет превышать тысячи долларов.

Ученые рассчитывают, что эта удивительная новая технология произведет очередную революцию в генетике человека — в частности, будет способствовать скорейшему выявлению в небольших родословных генетических мутаций, не обнаруживаемых тестами на сцепленное наследование. Эти достижения также окажут положительное влияние на диагностику — в ближайшем будущем секвенировать полный геном пациента станет быстрее и дешевле, чем производить таргетное секвенирование отдельных генов и областей.

- Рекомендуем далее ознакомиться со статьей "Механизм мутации генов и их полиморфизм"

Оглавление темы "Генетика заболеваний кожи.":
  1. Значение изучения генома человека в дерматологии
  2. Структура хромосомы и генов человека
  3. Механизмы и этапы экспрессии генов
  4. Выявление генов ответственных за заболевание
  5. Механизм мутации генов и их полиморфизм
  6. Менделевские болезни и варианты их наследования
  7. Хромосомные болезни с кожными проявлениями
  8. Митохондриальные болезни с кожными проявлениями
  9. Комплексная генетика кожных болезней
  10. Мозаицизм в генетике кожных болезней

Ваши замечания и вопросы: