В экспериментах по получению внутривидовых эмбриональных гибридных клеток путем слияния ЭСК мыши со спленоцитами взрослого животного (Матвеева и др., 1996) изучена характеристика таких цитогибридов, проведен анализ сегрегации родительских хромосом и дана оценка плюрипотентности гибридного генома (Серов и др., 2001). Для внутривидовых гибридных клеток, полученных от слияния клеток тератокарциномы с соматическими клетками, обычно характерен низкий уровень сегрегации хромосом с тетраплоидным или околотетраплоидным кариотипом (Rousset et al., 1983; Takagi et al., 1983; Forejt et al., 1984; Takagi, 1993; Mise et al., 1996).

Подобный хромосомный состав наблюдался в цитогибридах при слиянии первичных половых клеток с лимфоцитами (Tada et al., 1997). В то же время у межвидовых гибридных клеток, полученных в результате слияния мышиных тератокарциномных клеток с лимфоцитами норки, отмечалась интенсивная сегрегация хромосом соматического партнера (Serov et al, 1990).

Качественно новый этап исследования сегрегации родительских хромосом у внутривидовых гибридов наступил после разработки метода анализа микросателлитов с помощью поли-меразной цепной реакции, благодаря которому на каждую хромосому мыши найдено несколько сотен маркеров, позволяющих надежно дискриминировать любую пару гомологичных хромосом в гибридных клетках (Серов и др., 2001).

Путем слияния стволовых клеток (использовались клетки НМ-1, дефицитные по активности гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, 2n = 40, XY, выделенные из бластоцист мышей линии 129/01а) со спленоцитами мышей конгенной линии DD/c удалось получить набор гибридных клонов, морфологически имевших сходство с ЭСК (Magin et al, 1992; Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998). Все клоны были выделены на селективной среде, в которой возможен рост только клеток с активной гипоксантинфосфорибозилтрансферазой.

Электрофоретический анализ показал наличие у всех клонов аллельного варианта гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, характерного для мышей DD/c (Serov et al., 1994). С помощью цитогенетического анализа было установлено, что из четырех гибридных клонов три имели околодиплоидный набор хромосом. Один околотетраплоидный клон содержал две популяции гибридных клеток, одна из которых была тетраплоидной, а вторая, меньшая — диплоидной (Серов и др., 2001).

Анализ микросателлитов, позволяющий дискриминировать любую пару гомологичных хромосом мышей 129/01а и DD/c, в гибридных клонах с околодиплоидным набором показал, что в двух клонах произошла отчетливая преимущественная элиминация аутосом соматического партнера. Большинство аутосом в клонах HESS2 и HESS3 имели маркеры линии 129/01а, то есть, плюрипотентного партнера. Исключение составили хромосомы 1 и И: в клонах HESS2 и HESS3, наряду с маркерами НМ-1 клеток, в небольшом количестве присутствовали маркеры соматического партнера.

Такие результаты могут отражать неполноту сегрегации хромосом 1 и И соматического партнера и согласуются с цитогенетическими данными о том, что трисомия по этим хромосомам наблюдается в 30-40% клеток клонов HESS2 и HESS3 (Matueeva et al., 1998). Клон HESS4 существенно отличался по хромосомному составу: многие аутосомы в этом клоне происходили из генома ЭСК (хромосомы 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 и 17), однако хромосомы 1, 9, И, 12, 15, 16, 18 и 19 были представлены гомологами обоих родителей.

Количественное соотношение микросателлитов, маркирующих эти гомологичные хромосомы, примерно соответствовало 1:1. Это позволило авторам предположить, что один гомолог имеет происхождение из генома ЭСК, а другой — из дифференцированных клеток. В некоторых субклонах клона HESS4 наблюдалось присутствие только маркеров хромосом 18 и 19 соматического партнера. Полученные результаты свидетельствуют, что в клетках клона HESS4, помимо сегрегации хромосом соматического партнера, произошла элиминация одного или обоих гомологов перечисленных выше хромосом плюрипотентного генома, то есть, имела место двусторонняя сегрегация хромосом обоих родителей — явление весьма необычное, поскольку для цитогибридов характерна сегрегация хромосом только одного из родителей (Серов и др., 2001).

Кроме того, после 20-го пассажа все клоны гибридных клеток содержали исключительно маркеры Х-хромосомы соматического партнера, то есть, в клонах произошла замена Х-хромосомы ЭСК на Х-хромосому соматического партнера. Подтверждают этот важнейший факт данные in situ гибридизации с использованием ФИТЦ-меченого зонда, специфичного для Х-хромосомы мыши: позитивный сигнал обнаруживался только на одной хромосоме (Матвеева и др., 2001).

Следует отметить, что на более ранних сроках культивирования (до 15-го пассажа), согласно цитогенетическим данным, во многих клетках присутствовали две Х-хромосомы. Следовательно, использование селективных сред позволяет манипулировать хромосомным составом гибридных клеток и направленно отбирать клоны, несущие единичные хромосомы соматического партнера на фоне генома ЭСК (Серов и др., 2001).

- Читать далее "Хромосомный и генетический набор гибридных клеток. Плюрипотентность гибридных клеток"