При всех формах аутосомно-доминантных атаксий с идентифицированными генами возможно непосредственное выявление мутации, т.е. проведение прямой ДНК-диагностики болезни. При заболеваниях с «динамическими» мутациями — СЦА типов 1, 2, 3, 6, 7, 8, 10, 12, 17 и ДРПЛА — такая диагностика основана на амплификации тринуклеотидного (при СЦА 10 пентануклеотидного) участка гена. При электрофорезе продуктов амплификации мутантный аллель четко определяется как патологически удлиненный фрагмент ДНК, содержащий увеличенное надпороговое число тандемных повторов.

Для большинства форм атаксий различия между верхней границей нормальных аллелей и нижней границей мутантных аллелей составляют как минимум несколько триплетов (9—12 нуклеотидов и более), в связи с чем качественное электрофоретическое разделение нормальных и мутантных аллелей может проводиться по упрощенному экспресс-протоколу с использованием агарозного геля (см. рис. 38). При необходимости точного количественного определения числа тандемных повторов разделение продуктов амплификации проводится при радиоавтографии или на автоматическом секвенаторе — с использованием полиакриламидного геля, обладающего более высокой разрешающей способностью.

Это требуется, в частности, при проведении ДНК-диагностики СЦА6, поскольку при данной форме аутосомно-доминантной атаксии разница между нормальными (< 18 CAG-повторов) и мутантными аллелями (>20 CAG-повторов) является весьма небольшой и требует точной количественной оценки длины амплифицированных фрагментов гена.

В редких случаях при выраженной экспансии тринуклеотидных повторов (более 100 копий) ПЦР-диагностика болезни не представляется возможной. Это обусловлено весьма низкой эффективностью амплификации аллелей, содержащих сверхдлинные три- либо пентануклеотидные тракты. Такая проблема обычно возникает при диагностике форм СЦА8 и СЦА10, а также в ювенильных и раннедетских случаях других доминантных атаксий (особенно СЦА7), т.е. при заболеваниях, обусловленных крайней степенью тяжести мутации. Выявление указанных сверхдлинных аллелей представляет собой более трудоемкую задачу и проводится путем блот-гибридизации исследуемой геномной ДНК с соответствующими зондами.

При формах атаксий СЦА14 и СЦА27, обусловленных точковыми мутациями в генах PRKCG и FGF-14 различной локализации, прямая ДНК-диагностика и поиск мутаций связаны с тотальным скринингом всей кодирующей области указанных генов (SSCP-анализ, прямое секвенирование и другие методы мутационного скрининга). Технически это достаточно сложная и длительная процедура, однако необходимость в ней возникает нечасто в связи с исключительной редкостью данных генетических вариантов аутосомно-доминантных атаксий. То же, по-видимому, относится к СЦА4 и СЦА 5.

Серьезной проблемой при прямой ДНК-диагностике аутосомно-доминантных атаксий является генетическая гетерогенность данных заболеваний и необходимость «перебора» большого числа генов для выявления мутации в одном из них у конкретного больного. Следовательно, разработка рационального алгоритма генетического скрининга представляет собой важнейшую задачу при обследовании больных и семей с аутосомно-доминантными атаксиями. Такой алгоритм может базироваться на двух основных принципах - анализе клинической картины и сравнительной частоте различных форм атаксий в изучаемой популяции.

Те или иные особенности клинического синдрома могут позволить заподозрить конкретную генетическую форму атаксии и начать поиск мутации с анализа соответствующего гена. Так, наличие у больного с аутосомно-доминантной атаксией экстрапирамидной симптоматики позволяет с высокой вероятностью предположить экспансию CAG-повторов в гене ATXN3 (болезнь Мачадо—Джозеф), сочетание атаксии с дегенерацией сетчатки требует в первую очередь исследования гена ATXN7 и т.д.

Однако на основании клинической картины заболевания достаточно редко удается высказать обоснованное предположение о конкретной генетической форме СЦА: большинство случаев прогрессирующих аутосомно-доминантных спиноцеребеллярных атаксий характеризуются отсутствием каких-либо патогномоничных симптомокомплексов, которые могли бы служить надежными опорными пунктами для выбора «нужного» гена. В такой ситуации последовательность анализа генов определяется частотой отдельных генетических форм атаксий в изучаемой популяции. Например, как было указано выше, в России наиболее распространенной формой данных заболеваний является СЦА1 (мутация в гене ATXN1 на хромосоме 6р23), а мутации в трех основных генах — ATXN1, ATXN2 и ATXN3 — выявляются суммарно более чем у половины всех больных аутосомно-доминантными атаксиями.

Исходя из этого при обследовании больных в российской популяции прямую ДНК-диагностику следует начинать с анализа (CAG)n-повторов в генах ATXN1, ATXN2 и ATXN3.

Важным с практической точки зрения является вопрос, насколько часто мутации в обсуждаемых генах могут быть выявлены у больных с прогрессирующими атаксиями дегенеративной природы, не имеющих положительного семейного анамнеза. Такие случаи могут быть следствием ряда причин, таких как: новая мутация, ранняя смерть одного из родителей, ложное отцовство или отсутствие четких сведений о родственниках, антиципация в семье и манифестация болезни у ребенка раньше, чем у родителя.

В 1995—2003 гг. нами были обследованы 76 больных с различными спорадическими формами атрофии мозжечка (оливопонтоцеребеллярная атрофия, паренхиматозная кортикальная атрофия мозжечка, алкогольная кортикальная мозжечковая атрофия и др.). Лишь у одного из этих больных была выявлена мутация в гене ATXN2, тогда как во всех остальных случаях у пациентов не было выявлено мутаций в изучаемых генах.

Наши данные совпадают с результатами других авторов, согласно которым мутации в основных генах ATXN1, ATXN2, ATXN3, CACNL1A4 или SCA8 обнаруживаются в среднем лишь в0,8—4,4% случаев спорадических атаксий. Более того, у спорадических больных с фенотипом оливопонтоцеребеллярной атрофии (вариант множественной системной атрофии) мутации в известных генах аутосомно-доминантных атаксий вообще не выявляются (Bandmann О. et al., Schols L. et al.).

Таким образом, низкий процент положительных результатов ДНК-тестирования у больных с атаксиями без семейного анамнеза свидетельствует о том, что новые мутации в рассматриваемых генах представляют собой исключительную редкость. Можно заключить, что при отсутствии у больного с мозжечковой атаксией семейного анамнеза (при наличии четких сведений о здоровых родителях) вероятность обнаружения мутации в одном из генов аутосомно-доминантных атаксий невелика. Эта вероятность особенно низка при обследовании пациентов с оливопонтоцеребеллярной атрофией, и проведение ДНК-диагностики у таких больных с практической точки зрения нецелесообразно.

Для 13 форм прогрессирующих аутосомно-доминантных спиноцеребеллярных атаксий известна хромосомная локализация мутантного гена, однако сам ген и мутации в нем пока не установлены. В настоящее время оценить популяци-онную частоту данных форм атаксий не представляется возможным, поскольку их диагностика требует подтверждения генетического сцепления с соответствующими хромосомными локусами, что выполнимо лишь в редко встречающихся больших информативных родословных.

При обследовании таких больших семей ДНК-анализ проводится в 3 этапа:
1) Скрининг мутаций в генах СЦА-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -10, -12,-14,-17,-27 и ДРПЛА.
2) При исключении данных мутаций проводится анализ генетического сцепления с маркерами остальных локусов аутосомно-доминантных атаксий.
3) При подтверждении сцепления с одним из локусов, в обследуемой семье может проводиться косвенная ДНК-диагностика болезни у лиц из группы риска.

Сущность такой диагностики, подробно изложенной нами ранее (Иллариошкин С.Н. и др.), заключается в следующем: у тестируемого лица и у других больных индивидов в родословной определяется носительство конкретных аллельных вариантов генетических маркеров, тесно сцепленных с изучаемым геном. Если аллель, унаследованный тестируемым лицом, идентичен таковому у других больных родственников, делается вывод о носительстве тестируемым лицом мутантной хромосомы; в противном случае можно заключить, что тестируемым лицом унаследована «здоровая» хромосома.

Точность такой косвенной ДНК-диагностики обычно составляет около 96-98%; вероятность ошибки связана с возможностью рекомбинации в мейозе между изучаемым геном и выбранным генетическим маркером. Для повышения точности косвенной ДНК-диагностики рекомендуется одновременно исследовать несколько маркеров, тесно фланкирующих исследуемый ген с центромерной и теломерной стороны, а также по возможности использовать маркеры, локализованные внутри исследуемого гена.

- Читать "Лечение аутосомно-доминантных спиноцеребеллярных атаксий. Лекарства"

1. Диагностика аутосомно-доминантных спиноцеребеллярных атаксий
2. ДНК-диагностика спиноцеребеллярных атаксий
3. Лечение аутосомно-доминантных спиноцеребеллярных атаксий. Лекарства
4. Физическая реабилитация больных с аутосомно-доминантной спиноцеребеллярной атаксией
5. Профилактика аутосомно-доминантной спиноцеребеллярной атаксии
6. Эпизодическая атаксия 1-го типа - клиника, диагностика, лечение
7. Эпизодическая атаксия 2-го типа - клиника, диагностика, лечение
8. Эпизодическая атаксия 3-го типа - клиника, диагностика
9. Эпизодическая атаксия 4-го типа - клиника, диагностика
10. Эпизодическая атаксия 5-го типа - клиника, диагностика