В ядре и цитоплазме клеток присутствуют нуклеиновые кислоты двух видов — ДНК и РНК, и методы их обнаружения зависят от свойств тех структур, в которых они находятся. Задача осложняется тем, что при проведении гибридизации in situ приходится иметь дело с самыми разными объектами — от индивидуальных хромосом в метафазных пластинках до архивных залитых в парафин биоптатов.

Впервые метод гибридизации in situ с использованием 32Р-меченных зондов был описан в 1969 г.. Последующее развитие технологии рекомбинантных ДНК и методов изотопного мечения позволило выявлять уникальные гены на метафазных хромосомах. С разработкой нерадиоактивных методов мечения метод гибридизации in situ стал более безопасным и простым, и в настоящее время высокой чувствительности удается достичь и без применения радиоизотопов. С созданием зондов, меченных с помощью нерадиоактивных молекул-свидетелей, метод гибридизации in situ стал и более универсальным, поскольку для обнаружения нужных молекул теперь появилась возможность использовать имунные и аффинные гистохимические методы. Дальнейшее совершенствование методологии гибридизации in situ позволит применять этот метод в клинической практике как рутинный.

В наших статьях мы рассмотрим основные принципы гибридизации in situ, обращая внимание прежде всего на более приемлемые для рутинного применения в лабораторной практике неизотопные методы. Каждый раздел главы сопровождается описанием основных этапов метода в целом.Материал этой главы, с одной стороны, служит введением в методологию гибридизации in situ, а с другой — содержит практические данные и может рассматриваться как первый шаг к более полному знакомству с использованием гибридизации in situ в научных и диагностических целях.

Выбор методики. Выбор конкретной методики гибридизации, оптимальной для данного эксперимента, зависит от следующих факторов:
• природа нуклеиновой кислоты-мишени;
• чувствительность;

Нуклеиновая кислота-мишень. Методики выявления РНК и ДНК с помощью гибридизации in situ различаются . Это относится ко всем этапам — от получения клеток и тканей до способов детекции. Аналогичным образом, разные методические приемы необходимы для выявления вирусной ДНК в инфицированной клетке и локализации геномной ДНК в той же ткани. Выбор того или иного варианта гибридизации in situ определяется характером эксперимента, и описанные в этой и последующих главах методы могут служить только отправной точкой в решении конкретной экспериментальной задачи.

Чувствительность. Для выявления последовательностей, представленных небольшим числом копий (например, при эпидемиологическом изучении латентных вирусных инфекций), метод ГИС должен обладать высокой чувствительностью. Однако известны случаи, когда, напротив, лучше использовать малочувствительные методики. В качестве примера можно привести выявление повторяющихся последовательностей (типа повторов на длинном плече Y-хромосомы). Если использовать высокочувствительные методы, то будут регистрироваться не только эти высокоповторяюшиеся последовательности, но и последовательности на других хромосомах, где они представлены небольшим числом копий. Чувствительность метода зависит от особенностей всех его этапов, начиная от фиксации препарата и кончая выбором фермента для детекции.

Специфичность. Специфичность метода зависит как от условий гибридизации, так и от условий последующего отмывания препарата. Подробно вопросы специфичности ГИС будут рассмотрены ниже, но то, что есть возможность проводить гибридизацию в жестком или мягком режиме, является одним из достоинств метода, поскольку это позволяет выявлять последовательности-мишени, обладающие разной степенью гомологии с используемым зондом. Этот момент очень важен для диагностики инфекций, вызываемых вирусами близких видов. Необходимо отметить, однако, что прежде чем приступать к анализу, необходимо точно определить «разрешающую способность» конкретных условий гибридизации (более подробно эти вопросы рассмотрены в работе. Далее, все сказанное выше предполагает, что получаемый при гибридизации сигнал обусловлен специфичной гибридизацией зонда с гомологичной мишенью в ткани. Убедиться в этом можно, проведя соответствующие контрольные опыты.

Лабораторные аспекты. Безопасность метода ГИС зависит от характера используемых молекул-свидетелей. Неизотопные его варианты значительно более безопасны, чем те, в которых используются радиоактивно меченные зонды. Стоимость анализа определяется затратами на иммуноцитохимический тест и на очистку и мечение зондов. Эти затраты сильно зависят от используемых зондов и способов мечения. Окончательный выбор того или иного метода зависит также от наличия нужных оборудования и реактивов.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."