Как и при любом электронно-микроскопическом исследовании, для сохранения структуры ткани препарат необходимо как можно скорее фиксировать. Пептиды НЭС — низкомолекулярные, хорошо растворимые вещества, и при фиксации их нужно иммобилизовать в ткани. Преципитирующие фиксаторы, например спирт или ацетон, здесь не подходят — они могут экстрагировать пептидные антигены и не обеспечивают сохранность ультраструктуры ткани. Лучше использовать такие фиксаторы, как параформальдегид и глутаральдегид; они сшивают активные пептидные группы, а последующая обработка тетроксидом осмия фиксирует липидные мембраны. Однако фиксация не должна быть продолжительной, чтобы не повредить сайты связывания антигенов и не блокировать иммуноцитохимическое связывание. Для каждого антигена следует опытным путем подобрать наилучший фиксатор.
При работе с животными максимально быстрое и эффективное проникновение фиксатора в исследуемые органы обеспечивает перфузия.

Фиксаторы могут быть гиперосмотическими (как правило, они дают хорошие результаты, но иногда происходит экстракция некоторых антигенов) или изоосмотическими (по-видимому, последние предпочтительнее). Ниже мы детально рассмотрим некоторые из используемых в нашей лаборатории фиксаторов. Какодилатный буфер можно заменить фосфатным. Какодилат токсичен и может повредить нефиксированные клетки, но его используют для длительного хранения фиксированного материала, поскольку опасность зарастания в таком буфере меньше, чем в фосфатном. Можно готовить фиксаторы на фосфатном буфере, а хранить ткани в какодилатном.

а. Глутаральдегид. Готовят 2,5% (в/о) глутаральдегид в 0,1М фосфатном буфере, рН 7,2. Хранят раствор при 4 °С. Глутаральдегид поступает в продажу в виде 25% раствора, иногда сверхчистого, но последнее непринципиально.

б. Тетроксид осмия. В темный флакон с 50 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,0, погружают ампулу, содержащую 0,5 г тетроксида осмия; разбивают ампулу и оставляют флакон в таком виде на ночь для перемешивания его содержимого. Хранят раствор при 4 "С. Пары осмия токсичны, поэтому готовить раствор и выполнять все операции следует в вытяжном шкафу.

в. Глутаральдегид-формальдегидные смеси Параформальдегид (для быстрого проникновения в ткань и фиксации антигенов) в фосфатном буфере смешивают с глутаральдегидом (для лучшего сохранения ультраструктуры) в разных пропорциях. Например, берут 4% параформальдегид/0,2% глутаральдегид; 3% параформальдегид/2% глутаральдегид (для быстрой фиксации); 2% параформальдегид/1% глутаральдегид.
Свободный от примесей (например, метанола) параформальдегид присутствует в имеющихся в продаже растворах формалина; его можно приготовить, как описано в протоколе.

4% параформальдегид в 0,1 М фосфатном буфере:

1. Взвешивают 8 г параформальдегида и растворяют его в 90 мл дистиллированной воды, размешивая при температуре 60 "С в вытяжном шкафу.
2. Добавляют по каплям 1,0 М гидроксид натрия, пока раствор не станет прозрачным.
3. Охлаждают раствор, доводят рН до 7,4 и добавляют дистиллированную воду до 100 мл.
4. Добавляют 100 мл 0,2 М фосфатного буфера, рН 7,4, и фильтруют раствор.

г. Периодат—лизин—параформальдегид. Этот препарат специально создан для фиксации гликопротеинов клеточных мембран, однако он дает хорошие результаты и в других случаях, в частности при фиксации слизистых тканей и гликопротеиновых гормонов гипофиза. Приготовление этого фиксатора детально описано в протоколе.

Периодат—лизин—параформальдегид:

Раствор А:
0,1 М L-лизингидрохлорид в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,4 1.
Растворяют 1,827 г L-лизингидрохлорида в 50 мл дистиллированной воды.
2. Доводят рН до 7,4 с помощью 0,1 М гидрофосфата натрия.
3. Доводят объем до 100 мл 0,1 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,4.
4. Хранят раствор при 4 °С не более 10 сут.

Раствор Б: 8% параформальдегид
5. Готовят в соответствии с пп. 1-2 протокола. Профильтрованный раствор хранят при 4 °С
6. Непосредственно перед фиксацией смешивают три части раствора А (15 мл) с одной частью раствора Б (5 мл). Добавляют метапериодат натрия до конечной концентрации 0,01 М (0,0428 г в 20 мл). Конечный рН раствора должен быть примерно равен 6,2.
д. Пикриновая кислота/параформальдегид в буфере Замбони: Этот фиксатор, объединяющий преципитирующее действие пикриновой кислоты и способность формальдегида сшивать аминогруппы, оптимален для выявления пептидов. Его приготовление описано в протоколе.

Фиксатор Замбони

1. Растворяют 20 г параформальдегида в 150 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты, постоянно помешивая, при температуре 60 "С в вытяжном шкафу.
2. Добавляют по каплям 0,1 М гидроксид натрия, пока раствор не станет прозрачным.
3. Фильтруют раствор, охлаждают и доводят объем до 1 л фосфатным буфером (3,31 г NaH2PO3 • 2Н20 и 33,77 г Na2HP03 7H20 в 1 л воды). Конечный рН 7,3, осмолярность 900 мОсм.
Имеется множество других фиксаторов, применяющихся в разных конкретных случаях. Описанные здесь фиксаторы с успехом используются нами для иммуноцитохимии пептидов. В общих чертах процедура фиксации описана в протоколе. Если важно сохранить ультраструктуру, несколько кусочков ткани следует дополнительно зафиксировать тетроксидом осмия. После фиксации осмием некоторые пептиды можно пометить иммунологически, предварительно обработав срезы метапериодатом.

1. Фиксируют маленькие кусочки ткани (> 1 мм3) в подходящем фиксаторе от 30 мин до 2 ч при 4 С.
2. Промывают их при 4 °С в трех сменах 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,2, содержащего 0,1 М сахарозу, по часу в каждой сме не. Оставляют ткань в этом же буфере на 1 ч или дольше, помня что при длительном хранении в буфере некоторые антигены могут экстрагироваться вследствие частичного разрушение сшивок.
3. Для сохранения морфологии и фиксации наиболее «трудных» пептидов выдерживают отдельные препараты в течение 1 ч и тетроксиде осмия.
4. Промывают кусочки ткани в буфере.
5. Дегидратацию и заключение в смолу проводят.

- Читать далее "Смолы в иммуноцитохимии. Фиксация препаратов смолами"