Можно приготовить препараты коллоидного золота, различающиеся по диаметру частиц, и проводить окрашивание одновременно по двум антигенам. При этом следует помнить, что используемые антитела не должны давать перекреста.

Выбор конкретной методики зависит от происхождения первых антител. Если имеются мышиные моноклональные антитела к одному антигену и кроличьи поликлональные антитела к другому, можно использовать одновременное двойное мечение — наиболее простой и эффективный способ. Оба первых антитела наносят на препарат в виде смеси с заранее выбранной оптимальной концентрацией каждого антитела. Затем наслаивают два меченных золотом с разным размером гранул антитела к мышиным и кроличьим иммуноглобулинам.

Антитела происходят от одного вида или от видов, не дающих перекрестной реакции. Например, можно использовать козьи антитела к IgG мыши, связанные с частицами золота диаметром 10 нм, и козьи антитела к IgG кролика, связанные с частицами золота диаметром 20 нм. Этот метод аналогичен методу одноэтапного мечения. Козьи антитела к IgG кролика можно заменить овечьими, поскольку эти виды родственны, но не кроличьими антителами; последние дают перекрестную реакцию с козьими (овечьими) антителами к IgG кролика.
Очень важен относительный размер частиц золота; например, следует использовать частицы диаметром 10 и 20 нм, а не 15 и 20 нм.

При условии, что используемые вторые антитела не дают перекрестной реакции, метод непрямого мечения можно с успехом комбинировать с биотинилированием второго антитела и нанесением третьего слоя — конъюгированного с золотом авидина. Однако использование даже последовательно наслаиваемых авидинбиотиновых комплексов проблематично, поскольку вторые биотинилированные антитела могут связываться со свободными участками первых, связанных с меченным золотом биотином.

Для блокирования свободных мест связывания между первыми антителами, конъюгированными с авидином, и вторыми, биотинилированными антителами, должен находиться слой неконъюгированного биотина.

Аналогичные проблемы возникают в случае двойного мечения с использованием комплекса белок А — золото. В данном случае наслаивание не может быть одновременным даже для двух первых антител. Этот метод используется тогда, когда два первых антитела происходят от одного и того же вида. После идентификации первого антитела с помощью конъюгата белка А с частицами золота одного размера свободные сайты связывания белка А на молекулах первого антитела блокируют немеченым белком А, а затем наносят раствор антитела ко второму антигену.

Эти антитела будут связываться со своим антигеном в ткани, а некоторые молекулы — также с «промежуточным» белком А, связанным с первым антигеном. Однако когда все сайты связывания белка А на молекулах первого антитела будут заняты, они уже не смогут связываться с белком А третьего слоя, меченным частицами золота другого размера.

Еще один способ двойного мечения с помощью первых антител от одного и того же вида состоит в мечении одного антигена с одной стороны сеточки, а второго — с обратной стороны. Срезы настолько тонкие, что под микроскопом видны обе стороны, как зудто метки находятся на одной поверхности. Антитела наносят последовательно; сеточки помещают на капли растворов антител так, чтобы они плавали на поверхности, не погружаясь, что предотвращает переход антител с одной поверхности на другую. Для этого после нанесения метки на одну из сторон покрывают сеточку с этой стороны формваровой пленкой и лишь потом метят вторую сторону.

Следует иметь в виду, что для реагентов доступна только поверхность среза, поэтому более глубокие структуры, абтонированные лишь на обратной стороне среза, могут связывать только вторые антитела, хотя содержат два антигена.

Наконец, при третьем способе двойного мечения с использованием первых антител от одного и того же вида сначала наносят первое антитело, меченное золотом, затем сеточки промывают в дистиллированной воде и осушают. Далее их выдерживают 15-60 мин в парах формальдегида, образующихся над порошком параформальдегида, в плотно закрытом бюксе при 80 °С; время экспозиции подбирают опытным путем. При этом блокируются все сайты связывания в первом слое иммуноглобулиновых реагентов. Затем сеточки промывают, чтобы удалить избыток формальдегида, и наносят второе антитело, конъюгированное с золотом. Необходимо убедиться в сохранности антигенов после обработки образца горячими формальдегидными парами и в полном блокировании сайтов связывания иммуноглобулина.

Для этого на срез наносят раствор любого антитела от того же вида, от которого взяты первые антитела и вторые антитела к иммуноглобулину, меченные золотом. Все операции с формальдегидом следует проводить в вытяжном шкафу.

Комбинируя эти методы, на одном и том же препарате можно пометить три и более антигенов. Например, при двойном мечении антителами, конъюгированными с золотом, с каждой из двух сторон сеточки можно выявить четыре антигена. С ростом числа антигенов требования к размеру частиц золота становятся все строже. Желательно измерить на электронных микрофотографиях отдельные частицы конъюгированного с соответствующими реагентами золота в капельках, иммобилизованных на поли-L-лизиновой или формваровой пленке.

- Читать далее "Контроль в электронно-микроскопической иммуноцитохимии. Виды контроля в электронной иммуноцитохимии"