Лабораторная диагностика злокачественных опухолей легких

С каждым годом лабораторная диагностика становится все более комплексной, сложной и специализированной. Фактически для каждой опухоли эксперты выделяют несколько подкатегорий; подчас нам приходится идти впереди наших возможностей. В каждой части данного раздела предпринята попытка представить современный уровень развития методов без их детализации.

а) Гистологические и цитологические методы. В большинстве случаев лабораторная диагностика двух крайних вариантов опухолей — доброкачественных и злокачественных — не вызывает проблем. Однако существуют так называемые пограничные опухоли, когда диагностический поиск следует проводить очень осторожно и тщательно. Необходимо подчеркнуть важность взаимодействия клиницистов (в основном хирургов) и патологоанатомов в постановке правильного диагноза.

Клиницисты имеют тенденцию недооценивать свой вклад в диагностику опухолей, однако клинические данные для постановки точного патологоанатомического диагноза чрезвычайно важны. Индуцированные радиацией изменения кожи или слизистой оболочки нередко напоминают таковые при злокачественных опухолях, а гистологические изменения в области заживающего перелома похожи на ткань остеосаркомы. Точность лабораторной диагностики опухолей зависит от качества образца, предоставленного для экспертизы.

Образец должен быть адекватным, репрезентативным и сохранным. Существует несколько способов изъятия материала: (1) эксцизия и биопсия; (2) тонкоигольная аспирационная биопсия; (3) цитологический мазок.

б) Эксцизия и биопсия. Необходимо помнить, что иногда выполнить биопсию невозможно из-за малых размеров новообразования. Следует также понимать, что в крупных опухолях нужно выбрать правильное место для биопсии, т.к. краевая зона, возможно, не будет репрезентативной, а центр опухоли в значительной степени некротизирован.

Необходима правильная фиксация образца, а именно полное погружение образца в фиксатор (обычно в раствор формалина, но возможно использование и других растворов). Для электронной микроскопии материал подвергают специальной фиксации (например, в глутаральдегиде), а для оптимального определения гормонов, рецепторов и других молекул — замораживанию.

Изучение замороженных срезов в ряде случаев является незаменимым исследованием, например при определении природы опухоли или выявлении опухолевых клеток в краях резекции при полной эксцизии новообразования. Этот метод, при котором образец быстро замораживают и нарезают, позволяет провести гистологическую оценку в течение нескольких минут. Такая диагностика, проведенная опытным специалистом, очень достоверна, тем не менее существуют особые случаи, когда необходимо улучшить качество гистологических препаратов (путем длительной обработки материала), например при таких крайне радикальных операциях, как ампутация конечностей. При этом лучше подождать несколько дней, чем выполнить неадекватную или ненужную операцию вследствие неточной диагностики.

Шейки матки в норме
Нормальный мазок из шейки матки.
Визуализируются большие клетки плоского эпителия с мелкими ядрами и клетки метаплазированного эпителия, между которыми располагаются нейтрофилы.
Атипичные клетки отсутствуют.

в) Тонкоигольная аспирационная биопсия. Этот метод заключается в аспирации клеток из ткани с последующим цитологическим исследованием мазков. Хирургического изъятия материала не нужно. Такую биопсию используют, как правило, при наличии легко пальпируемых опухолей молочной железы, щитовидной железы, слюнных желез и лимфатических узлов. Современные методы воспроизведения изображения позволяют применять метод при исследовании глубоких структур, таких как печень, поджелудочная железа и тазовые лимфатические узлы, что избавляет пациента от дополнительного хирургического вмешательства и сопутствующего риска.

Тонкоигольная аспирационная биопсия является более быстрым методом по сравнению с обычной игольной биопсией, менее инвазивна и сопряжена с меньшим риском. Хотя существуют некоторые трудности (например, маленький размер опухоли или ошибка выборочного исследования), тем не менее метод характеризуется высокой надежностью и скоростью.

г) Цитологическое исследование мазков, окрашенных по Папаниколау. Такое исследование мазков проводят для диагностики злокачественных опухолей. Его широко используют для выявления карциномы шейки матки (часто на стадии злокачественных опухолей in situ), а также многих других форм предопухолевых состояний и злокачественных новообразований, например эндометриальной или бронхогенной карциномы, рака мочевого пузыря, предстательной железы и карциномы желудка.

Метод также позволяет идентифицировать опухолевые клетки в перитонеальной, плевральной, суставной и спинномозговой жидкостях. Для выявления других форм неоплазий цитологические мазки используют реже.

Как указывалось ранее, опухолевые клетки по сравнению с другими клетками в меньшей степени связаны друг с другом, а также обладают свойствами анаплазии (клеточной атипии), что указывает на их опухолевую природу. В отличие от гистологической диагностики при цитологическом исследовании суждения должны основываться на изменениях каждой клетки или групп клеток, при этом нет возможности оценить потерю ориентации опухолевыми клетками и (самое главное) наличие их инвазии в подлежащие ткани. Этот метод позволяет дифференцировать нормальные, диспластические и опухолевые клетки и высказать подозрение о карциноме in situ. Эффективный контроль рака шейки матки — лучшее подтверждение ценности цитологического метода.

Гистологический метод и эксфолиативная цитология остаются обычными методами диагностики злокачественных опухолей, однако современный патологоанатом использует постоянно пополняющийся арсенал современных технологий, что расширяет возможности диагностики. Иммуногистохимическое исследование — широко используемый метод, в то же время быстро развиваются методы молекулярной диагностики и начинают использоваться в качестве рутинных. Далее приведем основные характеристики этих диагностических методов.

Мазок опухолевых клеток
Патологический мазок, содержащий пласт опухолевых клеток с полиморфными,
крупными гиперхромными ядрами, между которыми располагаются нейтрофилы.
Отмечается ядерный полиморфизм, а также видна одна фигура митоза.

д) Иммуногистохимическое исследование. Доступность специфических антител значительно расширила возможности идентификации белковых продуктов клеток и поверхностных клеточных маркеров. Приведем примеры значимости использования иммуноги-стохимического исследования в диагностике и контроле злокачественных опухолей:

- классификация недифференцированных злокачественных опухолей. Злокачественные опухоли различного происхождения с нарушением дифференцировки напоминают друг друга. Такие опухоли бывает трудно различить на основании срезов, окрашенных гематоксилином и эозином (рутинное окрашивание). Например, некоторые анапластические карциномы, лимфомы, меланомы и саркомы могут иметь похожий вид при гистологическом исследовании, однако они отличаются методами лечения и прогнозом. В таких случаях выявление антител к промежуточным филаментам отражает наличие клеток солидных опухолей, что имеет диагностическую ценность. Например, иммуногистохимическое выявление цитокератинов подтверждает эпителиальную природу опухоли (карциному), а присутствие десмина является специфическим для опухолей мышечного происхождения — миосарком;

- определение локализации и происхождения первичной опухоли по исследованию метастазов. Многие пациенты со злокачественными опухолями впервые обращаются к врачу уже на стадии метастазирования. В ряде случаев локализация первичной опухоли очевидна или ее возможно определить клиническими и радиологическими методами. В тех случаях, когда локализация первичной опухоли не ясна, может быть полезным иммуногистохимическое выявление ткане- или органоспецифических антигенов в биоптатах метастазов. Например, простат-специфический антиген (PSA) и тиреоглобулин являются маркерами карцином предстательной железы и щитовидной железы соответственно;

- определение молекул, имеющих прогностическое и терапевтическое значение. Иммуногистохимическое определение рецепторов гормонов (эстрогенных/прогестероновых) при раке молочной железы имеет помимо прогностического значения (рецептор-положительный рак молочной железы имеет лучший прогноз) и терапевтическое значение при оценке чувствительности к антигормональной терапии. Также иммуногистохимически при раке молочной железы может быть выявлен белковый продукт онкогена ERBB2 (рак молочной железы с повышенной экспрессией ERBB2 в целом имеет худший прогноз). Обычно при гиперэкспрессии ERBB2 определяют амплификацию участка хромосомы с геном ERBB2 методом FISH (см. далее).

Иммунопероксидазная реакция
Иммунопероксидазная реакция с антителами к цитокератинам в ткани опухоли эпителиального происхождения (карциномы).

е) Проточная цитометрия. Проточная цитометрия позволяет быстро и количественно оценить ряд индивидуальных характеристик опухолевых клеток, например наличие мембранных антигенов и ДНК. Проточная цитометрия доказала свое значение для идентификации и классификации опухолей Т- и В-клеточного, а также мононуклеарного происхождения.

ж) Молекулярная диагностика. Для диагностики опухолей и прогнозирования исхода применяют молекулярные методы (некоторые устоявшиеся, другие разрабатываются). Задачи молекулярной диагностики:

- диагностика злокачественных опухолей. Молекулярные методы не относятся к основным методам первичной диагностики злокачественных опухолей, но чрезвычайно важны в ряде случаев. Молекулярные методы полезны в дифференциальной диагностике доброкачественной (поликлональной) пролиферации Т- и В-клеток и злокачественной (моноклональной). Поскольку каждая Т- и В-клетка имеет уникальную группировку генов антигенного рецептора обнаружение с помощью ПЦР рецептора Т-клеток или генов Ig позволяет дифференцировать моноклональные (относящиеся к новообразованиям) и поликлональные (реактивные) клеточные пролифераты. Поскольку во многих опухолях системы кроветворения (лейкемиях и лимфомах) и в некоторых паренхиматозных неоплазиях обнаруживаются специфические транслокации, которые активируют онкогены, диагноз можно поставить, обнаружив их.

Выявление таких транслокаций обычно осуществляют методами рутинного цитогенетического анализа или методом FISH. В ряде случаев молекулярные методы, такие как ПЦР, позволяют выявить минимальную остаточную болезнь, которая не определяется при обычном анализе. В диагностике сарком, содержащих характерные транслокации, также помогают молекулярные технологии, поскольку приготовление хромосомных препаратов из солидных опухолей затруднительно. Например, многие саркомы у детей, образно называемые опухолями из мелких синих клеток, трудно дифференцировать на основании только морфологии. Однако наличие в такой опухоли транслокации t(11;22)(q24;ql2), выявленной с помощью ПЦР, подтверждает диагноз «саркома Юинга».

Молекулярный цитогенетический метод, носящий название спектрального кариотипирования, обладает высокой чувствительностью и позволяет изучать все хромосомы одновременно. Этот метод основан на 24-цветовой гамме окрашивания хромосом смесью флуорохромов, позволяет выявлять любые нарушения хромосом в опухолевых клетках, даже небольшие скрытые транслокации и вставки. С помощью этого метода можно также определить происхождение неидентифициро-ванных хромосом, называемых маркерными хромосомами, обнаруживаемых во многих злокачественных опухолях системы кроветворения. Другой доступный метод — сравнительная геномная гибридизация (в настоящее время его используют в формате микрочипирования). Этот метод позволяет изучать хромосомный профиль опухолевых клеток. Применение ДНК-микрочипов, тилинг-чипов, которые покрывают весь геном человека, или SNP-чипов позволяет изучать амплификацию и делецию генов с высокой точностью;

- прогноз злокачественных опухолей. Определенные генетические изменения связаны с плохим прогнозом, следовательно, наличие таких изменений определяет тактику лечения пациента. Например, амплификация гена N-MYC и делеция 1р предрекают плохой прогноз при нейробластоме, а амплификация HER2/Neu при раке молочной железы свидетельствует о возможности эффективного использования терапии антителами к рецептору ERBB2. Генетические изменения можно определить цитогенетически либо с помощью метода FISH или ПЦР. Пациенты, имеющие олигодендроглиомы с единственной генетической аномалией в виде утраты хромосом 1р и 19q, отличаются длительной выживаемостью и лучшим ответом на терапию по сравнению с теми, кто имеет интактные хромосомы 1р и 19q в сочетании с амплификацией рецепторов EGF;

- обнаружение минимальной остаточной болезни. Другое направление молекулярных методов — обнаружение минимальной остаточной болезни после лечения пациентов с лейкемией либо лимфомой или рецидива. Для этого используют мониторирование амплификации методом ПЦР последовательностей нуклеиновых кислот, уникальных для определенного клона опухолевых клеток. Например, обнаружение методом ПЦР транскриптов BCR-ABL позволяет представить масштаб минимальной остаточной болезни у пациентов, получающих лечение по поводу хронической миелоидной лейкемии. Обнаружение специфической мутации гена KRAS в образцах стула пациентов, перенесших ранее лечение по поводу рака толстой кишки, свидетельствует о возможном рецидиве опухоли. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни определяют при острой лимфобластной лейкемии и оценивают при других опухолях;

- диагностика наследственной предрасположенности к злокачественным опухолям. Мутации в зародышевых клетках некоторых генов-супрессоров опухолей, таких как BRCA1, BRCA2, а также протоонкогена RET увеличивают риск развития у пациента определенных форм злокачественных опухолей. Обнаружение этих мутантных аллелей позволяет врачу разработать «агрессивный» протокол скрининга, рассмотреть возможность профилактического хирургического вмешательства, а также провести генетическое консультирование родственников. При диагностике наследственной предрасположенности определяют специфические мутации (например, гена RET) или проводят секвенирование всего гена. Последнее необходимо в случаях, когда существует несколько мутаций в гене, связанных с развитием опухоли. Выявление таких мутаций — достаточно прогрессивный метод профилактики, однако следует учитывать этическую сторону диагностики состояния предболезни.

Методика оценки экспрессии генов методом ДНК-микрочипирования
Стадии анализа глобальной экспрессии генов методом ДНК-микрочипирования.
РНК экстрагируют из образцов нормальной и опухолевой тканей.
Для каждого образца синтезируют комплементарную ДНК (кДНК) с флуоресцентной меткой (в данном случае зеленые молекулы использовали для нормальной кДНК, а красные молекулы — для опухолевой кДНК).
Чип состоит из плотной стеклянной подложки с фрагментами ДНК из тысяч известных генов, нанесенными в виде пятен.
Меченые кДНК из опухоли и нормальной ткани смешивают, наносят на чип. Происходит гибридизация с чипом.
Флуоресцентные сигналы при сканировании чипа конфокальным лазером фиксируют и загружают в компьютер для анализа
(красные участки соответствуют более высокой экспрессии генов в опухолях, зеленые — более высокой экспрессии в нормальных тканях, черные означают отсутствие различий).
На дисплее все горизонтальные линии соответствуют генам, содержащимся в чипе; каждая вертикальная линия — одному образцу.
мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота.

- Рекомендуем ознакомиться со следующей статьей "Молекулярные профили опухолей и их характеристика"

Оглавление темы "Патофизиология":
  1. Местное и гормональное действие опухоли
  2. Механизмы снижения веса при опухоли - опухолевой кахексии
  3. Паранеопластический синдром и его характеристика
  4. Классификация и стадирование опухолей TNM
  5. Лабораторная диагностика злокачественных опухолей легких
  6. Молекулярные профили опухолей и их характеристика
  7. Маркеры опухоли - онкомаркеры
  8. Классификация возбудителей инфекции - инфекционных агентов
  9. Методы выявления возбудителей инфекции (инфекционных агентов)
  10. Новые инфекционные болезни и их характеристика