В Национальном институте здоровья США на основании обобщения существующих сведений о методах выделения линий ЭСК человека из бластоцисты было сделано предварительное заключение о том, что успешное выделение ЭСК наиболее вероятно при культивировании бластоцист с хорошо сформированной внутренней клеточной массой (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

С этой точки зрения, оптимальным источником ЭСК для создания линий являются бластоцисты человека 5-го дня развития, из которых при выделении внутренней клеточной массы следует тщательно удалять трофэктодерму. Изолированную внутреннюю клеточную массу, состоящую на этой стадии из 30-35 клеток, необходимо культивировать на подложке эмбриональных мышиных фибробластов, что является решающим условием для образования в культуре колоний ЭСК.

Сохранение плюрипотентности и стабильности генома линий ЭСК достигается только при соблюдении достаточно жестких условий их культивирования. После выделения бластоцисты клетки внутренней клеточной массы или изолированный эпи-бласт необходимо выращивать на фидерном слое эмбриональных фибробластов, пролиферация которых блокируется добавлением митомицина С или ионизирующей радиацией.

Фидерный слой стромальных клеток обеспечивает ЭСК мезенхимальную поддержку для выживания, блокировки апоптоза и пролиферации в культуре посредством продукции цитокинов и факторов роста, прямого контакта ЭСК с адгезивной подложкой, необходимого для формирования цитоскелета, а также путем создания иммунного барьера.

Совершенно обязательным является присутствие в среде культивирования LIF. Для сохранения стабильности генома ЭСК и наиболее ранних прогениторных клеток, локализованных в ядре клона, в среду необходимо добавлять LIF, SCF и IL-6, а пролиферация более продвинутых периферических популяций требует присутствия FGF, EGF, TGF-a и других митогенов.

Поэтому для размножения ЭСК проводится весьма трудоемкая процедура диспергирования эмбриональных телец с выделением из ядра клона истинных ЭСК. Фактически все линии ЭСК из бластоцисты, длительно сохраняющие нормальный кариотип и высокую активность теломеразы, были получены из разных клонов. При этом гетерогенность ЭСК в разных клонах одного вида или в клонах разных видов остается практически не изученной (Репин, 2001).

В качестве одного из вариантов кондиционной среды для размножения ЭСК мышей можно использовать среду DMEM, состав которой расширен добавлением LIF, эмбриональной телячьей сыворотки, аминокислот, нуклеозидов и меркаптоэтанола (Nichols, 2001). При этом внешний сигнал LIF в синергизме с белками-сайленсерами Oct3/Oct4 удерживает геном пролиферирующих ЭСК в тотипотентном состоянии.

Установлено, что у мышей Oct4 экспрессирован только во внутренней клеточной массе бластоцисты, однако его экспрессия активирует ген, контролирующий синтез FGF4 в клетках трофобласта. Интересно, что двойной нокаут гена oct4 приводит к элиминации герменативного эпителия, в результате чего у мышей oct4 отсутствуют клоны первичных половых клеток. Считается, что особенности ультраструктуры ЭСК отражают их способность к плюрипотентной дифференцировке: крупное, занимающее большую часть клетки ядро характерно для делящихся недифференцированных клеток.

ЭСК мышей линии R1, рост которых в недифференцированном состоянии поддерживается в культуре на стромальном фидере, формируют многослойные колонии с быстро увеличивающимися размерами вследствие высокой скорости деления этих клеток (Мануйлова и др., 2001).

- Читать далее "Функциональная роль LIF. Влияние LIF на ткани"