До недавнего времени считалось, что получить из трофобласта ЭСК невозможно. Однако линия диплоидных стволовых клеток трофэктодермы, выделенная из бластоцисты, в среде, где вместо LIF содержится FGF2 и гепарин, пролиферирует и трансформируется в стволовые клетки (Rossant, 2001). Если удалить из среды FGF2, то клетки трофэктодермы прекращают размножение, в них начинается эндоредупликация хромосом, и трофэктодермальные клеточные элементы постепенно преобразуются в гигантские клетки трофобласта.

Вероятно, LIF не стимулирует пролиферацию клеток трофэктодермы вследствие того, что FGF2 запускает иной механизм транссигнализации, поскольку FGF2, связываясь с плазматическим рецептором (FGFR2), активирует в цитоплазме МАР-киназы — ERK1 и ERK2. Следовательно, при включении в клетках бластоцисты одного сигнального пути (LIF — gpl30 — JAK-киназы — STAT3) клетки внутренней клеточной массы трансформируются в плюрипотентные ЭСК, а при активации второго механизма трансмембранной передачи сигнала (FGF2 — FGFR2 — МАР-киназы ERK1/ERK2) в бластоцисте образуются стволовые клетки трофэктодермы.

Выбор сигнального пути, в свою очередь, зависит от активности гена oct4. Этот ген, принадлежащий домену POU, расположен в локусе t аутосомы 17 и экспрессируется в процессе оогенеза, в период дробления, а также в клетках внутренней клеточной массы бластоцисты и в первичных половых клетках (Niwa, 2000; Smith, 2001). Функциональная роль гена oct4 заключается в кодировке транскрипционного фактора, необходимого для возникновения плюрипотентных клеток, их дифференцировки и дедифференциации (Niwa, 2001; Smith, 2001).

Экспрессия гена oct4 в ЭСК изменяется в зависимости от взаимодействия этого транскрипционного фактора с кофакторами. Направленная регуляция экспрессии oct4 в бластоцистах показала, что при снижении его активности половина клеток образует трофэктодерму, тогда как при повышении индуцированной экспрессии oct4 возникают преимущественно ЭСК.

В эксперименте ЭСК не удается перевести в линию при культивировании тотипотентных бластомеров на стадии дробления, а также на стадии гаструляции и более поздних стадиях эмбрионального развития (Brook, Gardner ,1997). Мышиные ЭСК обычно выделяют на 3,5-4,5-й день беременности, что соответствует шестой (однослойная бластоциста) и седьмой стадиям (двухслойная бластоциста — ранний яйцевой цилиндр) нормального эмбриогенеза.

Очевидно, что только в доимплантационном периоде зародыши мышей содержат клеточные популяции, способные трансформироваться в ЭСК. Следовательно, выделение линий ЭСК возможно лишь на определенных стадиях эмбриогенеза. Тотипотентными, с точки зрения возможности развития жизнеспособного эмбриона с зародышевыми оболочками и плацентой, являются зигота и возникающие в ходе дробления бластомеры. Утрата тотальной потенции зародышевых клеток начинается на стадии поздней морулы, когда дальнейшее коммитирование бластомеров зависит от их расположения. Бластомеры ранней морулы сохраняют тотипотентность, поскольку экспериментальные манипуляции с изменением их локализации, например инверсия их расположения, не препятствует развитию полноценного зародыша.

Установлено, что на эффективность выделения ЭСК в линию влияет состояние бластоцист в момент их эксплантации. Использование бластоцист после моделирования семидневной диапаузы в половом тракте мышей, овариоэктомированных на 3,5-й день беременности и получавших прогестерон, способствует более успешному выделению линий стволовых эмбриональных клеток (Evans, 1981; Robertson, 1987). Предполагается, что в таких условиях увеличивается число бластомеров, образующих внутреннюю клеточную массу. Не исключено также, что происходит удлинение клеточного цикла и большинство бластомеров переходит в фазу G0 (Brook, Gardner, 1997).

Кроме того, создание стабильных плюрипотентных линий ЭСК зависит от генотипа зародышей: достаточно легко ЭСК выделяются из бластоцист мышиной линии 129, значительно трудней их получить при использовании мышей CS7BL/6 и практически невозможно выделить линию ЭСК из бластоцист мышей СВА/Са. Очевидно, ранние зародыши обладают какими-то генетическими особенностями, влияющими на развитие линии плюрипотентных ЭСК. Тем не менее, при культивировании изолированного эпибласта (Brook, Gardner, 1997), а также с помощью селективного отбора дифференцирующихся клеток (McWhir, 1996) линии ЭСК из ранних зародышей мышей СВА/Са все же были выделены.

- Читать далее "Техника получения линий стволовых клеток. Селекция чистой популяции стволовых клеток"