Первые стабильные линии плюрипотентных EG-клеток человека были получены из первичных гоноцитов, выделенных из половых зачатков 5-9-недельных эмбрионов. Изолированные клетки культивировали на подложке инактивированных эмбриональных фибробластов мыши в среде DMEM с фетальной сывороткой, к которой добавляли меркаптоэтанол, форсколин, а также рекомбинантные ростовые факторы человека (FGF и LIF). Через 7-12 дней в культуре появились многоклеточные колонии, по морфологическим признакам и молекулярным маркерам соответствующие EG-клеткам человека.

После агрегации эти клетки формировали эмбриоидные тельца, при дальнейшем развитии которых появлялись специализированные клетки, характерные для производных всех трех зародышевых листков. На протяжении 10-20 пассажей EG-клеточные линии сохраняли нормальный кариотип и не теряли плюрипотентности (Shamblott, 1998).

Показано также, что сочетанное действие LIF, мембранносвязанного и растворимого факторов Steel, а также TGF-р изменяет программу развития первичных половых клеток. Вместо того чтобы прекратить митотические деления и начать дифференцироваться в направлении оогенеза или сперматогенеза, первичные половые клетки продолжают пролиферировать. После осуществления нескольких дополнительных митотических циклов они становятся схожими с клетками эпибласта и, теряя свойства предшественников половых клеток, преобразуются в плюрипотентные эмбриональные стволовые EG-клетки (Donovan, 1994).

Таким образом, в 1998 году из полового зачатка фетальной аутопсийной ткани человека впервые были выделены иммортализованные линии первичных половых клеток (Shamblott et al.t 1998). В эмбриогенезе человека первичные половые клетки появляются в желточном мешке на 3-й неделе развития, а на 4-5-й неделях эти клетки мигрируют в зону полового бугорка, где образуют дормантные популяции первичных гоноцитов.
В неактивном состоянии первичные половые клетки сохраняются в зародыше вплоть до рождения.

Линии первичных половых клеток выделяются из фетального полового бугорка 5-9-недельных эмбрионов, извлеченную ткань которого ex tempore обрабатывают смесью коллагеназ IV-V типов, гиалуронидазы и ДНКазы для повышения количественно-качественного выхода клеток. Первичные половые клетки в ткани фетального полового бугорка окружены стромальными (мезенхимальными) клетками Сертоли. Функциональное предназначение клеток Сертоли заключается в продукции антиапоптозных факторов (Fas-лиганд), митогенов, а также иммуносупрессоров, защищающих половые стволовые клетки от иммунной атаки со стороны организма.

Кроме того, стромальное микроокружение полового бугорка играет важную роль в созревании гамет. Выделенные первичные половые клетки высаживают в культуру над фидерным стромальным слоем, состоящим из фетальных фибробластов первых трех пассажей. Наиболее эффективной комбинацией митогенов признан комплекс, состоящий из LIF, FGF и форсколина (стимулятор образования цАМФ). Пролиферация первичных половых клеток in vitro требует добавления фетальной сыворотки, в присутствии которой размножение первичных гоноцитов в культуре сопровождается образованием клонов шаровидных, неприкрепленных к подложке клеток.

- Читать далее "Выделение эмбриональных стволовых клеток. Среды размножения стволовых клеток"