Перспективы выявления вируса папилломы. Молекулярные методы обнаружения микроорганизмов

HPV обнаружены во всех описанных на сегодняшний день случаях инвазивных опухолей и рака in situ. Таким образом, HPV может служить маркером злокачественных клеток. Вирус обнаружен в 70% мазков, взятых у женщин с дисплазией, и лишь в 3,5% мазков с нормальной цитологией. Наличие HPV в мазках указывает на повышенный риск развития рака шейки матки. Выявление потенциально онкогенных типов HPV с помощью ОРД S-ПЦР позволит прогнозировать новообразования, которые могут перерасти в инвазивные опухоли. Сейчас в нашей клинике проводят проверку этой гипотезы на обширном клиническом материале.

Возможно, скринингом HPV удастся заменить широкомасштабные цитологические исследования аномальных клеток у женщин старше 35 лет из группы риска. Это позволит проводить последующий цитологический анализ для выявления аномальных клеток только тем женщинам, в мазках которых обнаружен HPV. Многих женщин с дисплазией, у которых HPV не обнаруживается, не придется подвергать гинекологическому обследованию.

Предварительные результаты длительных исследований, проводимых в нашей лаборатории, позволяют предполагать, что развитие рака шейки матки всегда связано с присутствием в клетках HPV, в основном типов 16 и 18. Описанный в этой главе скрининг HPV, по-видимому, более надежен и занимает меньше времени, чем цитологический анализ мазков. Поэтому результаты клинических лабораторных исследований могут в недалеком будущем приобрести большое значение для разработки методов скрининга рака шейки матки.

Молекулярные методы обнаружения микроорганизмов

За последние десять лет появилось много литературных данных об использовании ДНК-зондов в качестве диагностического инструмента в клинических лабораториях. Поскольку геном каждого микроорганизма содержит уникальные видоспецифичные нуклеотидные последовательности, подобрав к ним соответствующие зонды, можно идентифицировать любой из патогенов. Это позволяет выявить микроорганизмы, которые трудно обнаружить с помошью культивирования, а кроме того, приводит к экономии времени и средств, затрачиваемых на выделение инфекционных агентов.

выявление вируса папилломы

В основе молекулярных методов лежит высокая специфичность комплементарного спаривания двух молекул ДНК: зонда и мишени (ДНК патогенного микроорганизма). Сначала двухцепочечную молекулу ДНК патогена денатурируют нагреванием или с помошью химических агентов. Затем берут нуклеиновую кислоту-зонд, комплементарную специфическому участку ДНК (или РНК) мишени, и проводят их гибридизацию. При этом зонд предварительно метят с помощью радиоактивных изотопов, ферментов или других лигандов, например биотина. В результате комплементарного спаривания зонда и последовательности-мишени образуются двухцепочечные дуплексы, которые затем детектируют тем или иным способом.
Нуклеиновая кислота-мишень может быть фиксирована на твердой подложке, находиться в растворе, в интактной клетке или ткани (in situ).

В зависимости от типа исследуемой ткани, выявляемого патогена и характера зонда применяют разные способы гибридизации, обеспечивающие максимальную чувствительность метода и надежность детекции.

Зонды для обнаружения патогенных организмов могут иметь разное происхождение, но в любом случае они должны быть специфичны в отношении генетического материала тех микроорганизмов, которые предполагается обнаружить. Для этого — в зависимости от поставленной задачи — создают видоспецифичные зонды или зонды, комплементарные уникальным последовательностям в геноме данного патогена. Зонд может представлять собой относительно протяженный участок (102—104 п. н.) геномной ДНК, полученный клонированием фрагментов генома патогенного организма. Протяженные зонды для одноцепочечных нуклеиновых кислот можно получить с помощью транскрипции in vitro, в результате которой образуются высокоспецифичные РНК-зонды.

В клинических лабораториях широко используют синтетические олиго-зонды длиной 12—100 нуклеотидов, которые синтезируют химическим путем, используя в качестве матрицы одноцепочечные ДНК. Часто такие зонды, предназначенные для обнаружения специфических патогенов, можно приобрести на фирмах. Гибридизация с короткими олигонуклеотидными зондами более специфична, чем с протяженными, и осуществляется быстрее, однако ее чувствительность ниже, поскольку в короткий зонд можно включить не так много молекул-свидетелей (меток). Чувствительность гибридизации с олигонуклеотидными зондами позволяют существенно повысить системы амплификации. Итак, при выборе зондов следует учитывать несколько факторов: наличие готовых препаратов или возможность синтеза олигонуклеотидных зондов самостоятельно, чувствительность и специфичность детекции, тип молекул-свидетелей, условия гибридизации.
Различные методы гибридизации, выбор и мечение зондов, выбор метки подробно описаны в предыдущих главах и в работе.

- Читать далее "Выявление кишечной микрофлоры молекулярными методами. Перенос колоний с селективной среды на твердую подложку"

Оглавление темы "Выявление микроорганизмов и вирусов с помощью ПЦР":
1. Хранение фильтров после гибридизации. Полимеразная цепная реакция
2. Изготовление препаратов для ПЦР. Консервативные и типоспецифичные праймеры вируса папилломы человека
3. Статегия скрининга HPV. Полимеразная цепная реакция на мазках шейки матки
4. Типоспецифичная ПЦР на мазках шейки матки. Блот-гибридизация для выявления вируса папиломы шейки матки
5. Мечение зондов для GP-ПЦР. 5-концевое мечение TS-ПЦР-зондов
6. Особенности скрининга вируса папилломы. Требования к скринингу вируса папилломы
7. Перспективы выявления вируса папилломы. Молекулярные методы обнаружения микроорганизмов
8. Выявление кишечной микрофлоры молекулярными методами. Перенос колоний с селективной среды на твердую подложку
9. Гибридизация нуклеиновых кислот иммобилизованных на фильтрах с ДНК-зондами. Техника гибридизации с ДНК зондами
10. Применение ПЦР для обнаружения патогенных микроорганизмов. Техника выявления микроорганизмов методами ПЦР

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: