Статегия скрининга HPV. Полимеразная цепная реакция на мазках шейки матки

С разработкой прямой ПЦР (без выделения ДНК) появилась возможность создания новой стратегии скрининга. Использование праймеров GP 5/6 позволяет в ходе одной реакции провести скрининг широкого спектра типов HPV, а то и всех генитальных HPV. После такого предварительного скрининга секвенированные HPV можно идентифицировать с помощью ПЦР при участии типоспецифичных (TS) зондов (TS-ПЦР). Отчетливо видны многочисленные полосы почти на всех дорожках. После гибридизации в мягких условиях, обеспечивающих гибридизацию смеси зондов с широким спектром типов HPV, наблюдаются слабые и интенсивные полосы. Материал этих полос использовался затем для проведения типоспецифичных ПЦР.

Полимеразная цепная реакция на мазках шейки матки с использованием консервативных праймеров (GP-ПЦР)
Материалы
• 10 х раствор для GP-ПЦР: 500 мМ КС1, 100 мМ трис-HCl, рН 8,3, 35 мМ MgCl2, 0,1% желатина
• Раствор dNTP: по 2 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP
• ДНК-полимераза AmpliTaq: 5 ВД/мкл (фирмы Perkin-Elmer Cetus, USA)
• Праймеры GPS и GP6: по 100 пмоль/мкл

скрининг HPV

Методика
1. Готовят смесь для 100 ПЦР, добавляя в пробирку на льду следующие компоненты в указанном порядке:
• Дистиллированная вода 2930 мкл
• 10 х раствор для GP-ПЦР 500 мкл
• Раствор dNTP 500 мкл
• GP5 25 мкл
• GP6 25 мкл
• ДНК-полимераза AmpliTaq 20 мкл

2. Добавляют 40 мкл смеси для ПЦР к 10 мкл неочищенного клеточного экстракта.
3. Добавляют несколько капель (~ 100 мкл) минерального масла
4. Проводят денатурацию прогреванием смеси при 95 °С в течение 4 мин и выполняют 40 циклов амплификации в термоцик лере (фирмы Biomed, Amtelstad, The Netherland или аналогичном). Каждый цикл включает: денатурацию при 95 °С в течение 1 мин, отжиг при 40 С в течение 2 мин, элонгацию при 72 С в течение 1,5 мин. Элонгация в последнем цикле идет на 4 мин дольше.

5. Отбирают 10 мкл ПЦР-продукта для электрофореза в 1,5% агарозном геле с трис-боратным буфером и бромистым этидием.
Результаты TS-ПЦР образцов, отобранных после GP-ПЦР. Для тестов использовали смесь праймеров, специфичных в отношении HPV 6,16,33 и HPV 11, 18 и 31. После Саузерн-блоттинга и гибридизации с олигонуклеотидными зондами, специфичными для HPV 6, 16, 33 и HPV 11, 18 и 31, можно определить тип HPV, основываясь на величине гибридизационного сигнала и длине амплифицированных фрагментов. Из 14 GP-ПЦР-позитивных соскобов 7 оказались TS-ПЦР-позтивными: в четырех из них обнаружен HPV 16, в трехдругих — HPV 18, HPV 31 и HPV 6, по одному типу в каждом. Все эти соскобы после GP-ПЦР обнаруживали интенсивную гибридизацию, при этом четыре из них оказались TS-ПЦР-негативными. Это указывает на присутствие в них пока не секвенированных или новых типов HPV, HPVX. Несеквенированные типы HPV можно идентифицировать методом дот-блотгибридизации, используя в качестве зондов известные клонированные, но не секвенированные последовательности HPV.
Новые типы HPV можно идентифицировать с помощью секвенирования и клонирования.

- Читать далее "Типоспецифичная ПЦР на мазках шейки матки. Блот-гибридизация для выявления вируса папиломы шейки матки"

Оглавление темы "Выявление микроорганизмов и вирусов с помощью ПЦР":
1. Хранение фильтров после гибридизации. Полимеразная цепная реакция
2. Изготовление препаратов для ПЦР. Консервативные и типоспецифичные праймеры вируса папилломы человека
3. Статегия скрининга HPV. Полимеразная цепная реакция на мазках шейки матки
4. Типоспецифичная ПЦР на мазках шейки матки. Блот-гибридизация для выявления вируса папиломы шейки матки
5. Мечение зондов для GP-ПЦР. 5-концевое мечение TS-ПЦР-зондов
6. Особенности скрининга вируса папилломы. Требования к скринингу вируса папилломы
7. Перспективы выявления вируса папилломы. Молекулярные методы обнаружения микроорганизмов
8. Выявление кишечной микрофлоры молекулярными методами. Перенос колоний с селективной среды на твердую подложку
9. Гибридизация нуклеиновых кислот иммобилизованных на фильтрах с ДНК-зондами. Техника гибридизации с ДНК зондами
10. Применение ПЦР для обнаружения патогенных микроорганизмов. Техника выявления микроорганизмов методами ПЦР

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: