Типоспецифичная ПЦР на мазках шейки матки. Блот-гибридизация для выявления вируса папиломы шейки матки

Материалы
• 10 х раствор для TS-ПЦР: 500 мМ КС1, 100 мМ трис-НСl, рН 8,3, 15 мМ MgCh, 0,1% желатина
• Раствор dNTP: по 2 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP
• ЦНК-полимераза. AmpliTaq: 5 ЕД/мкл (Perkin-Elmer, Cetus, USA)
• Праймеры, специфичные для HPV 6, 11, 16, 18, 31 и 33: по 100 пмоль/мкл каждого

Методика Готовят две разные многокомпонентные среды для ПЦР, содержащие олигонуклеотидные праймеры, специфичные для HPV 6, 16, 33 и HPV 11, 18, 31 соответственно.
1. Готовят две ПЦР-смеси, рассчитанные на 100 ПЦР-реакций каждая.
Смесь для HPV 6, 16,33:
• Дистиллированная вода 2830 мкл
• 10 х раствор для TS-ПЦР 500 мкл
• Раствор dNTP 500 мкл
• Каждый из праймеров для HPV 25 мкл 6.1,6.2,16.1, 16.2,33.1,33.2
• ДНК-полимераза AmpliTaq 20 мкл
Смесь для HPV 11, 18,31 готовят так же, как первую, но вместо праймеров для HPV6,16 используют праймеры для HPV И, 18.

2. К 10 мкл неочищенного клеточного экстракта добавляют 40 мкл смеси для ПЦР.
3. Добавляют несколько капель ( 100 мкл) минерального масла.
4. После 4-минутной денатурации при 95 С в течение 4 мин проводят 40 циклов амплификации в термоциклере (фирмы Biomed, Amtelstad, The Netherlands или аналогичном). Каждый цикл включает денатурацию при 95 С в течение 1 мин, отжиг при 40 С в течение 2 мин, элонгацию при 72 С в течение 1,5 мин. Элонгация в последнем цикле идет на 4 мин дольше.
5. Отбирают 10 мкл ПЦР-продукта для электрофореза в 1,5% агарозном геле с трис-боратным буфером и бромистым этидием.

пцр мазков шейки матки

Блот-гибридизация

Описанную ниже блот-гибридизацию можно успешно проводить на заряженных найлоновых фильтрах BioTrace RP (фирмы Gelman Science) и GenScreen Plus (фирмы NEN DuPont).

Материалы
• Предгибридизационная смесь: для приготовления 1 л смеси берут 248 мл дистиллированной воды, 500 мл 0,5 М Na2HP04, рН которого доведен до 7,4 фосфорной кислотой, 350 мл 20% ДСН и 2 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0
• Буфер для переноса: 0,6 М NaCl/0,4 M NaOH
• 20 х SSC: 3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0
• 2 х SSC, 0,2 М трис-HCI, рН 7,5
• Меченый зонд
• 3xSSC,0,5% ДCH

Методика
А. Блоттннг
Никакой предварительной обработки геля не требуется.
1. Готовят все необходимое для блоттинга, используя в качестве буфера для переноса 0,6 М NaCl/0,4 M NaOH.
2. Погружают фильтр на 10 мин в дистиллированную воду, затем помещают его на гель для переноса.
3. Проводят перенос в течение ночи, затем погружают фильтр на 15 мин в 2 х SSC/0,2 M трис-HCl; все это время слегка покачивают ванночку с раствором.
4. Помещают фильтр между двумя листами фильтровальной бумаги и хорошо высушивают. Никакой дополнительной обработки фильтров перед гибридизацией не требуется.

Б. Гибридизация
1. Вымачивают фильтры в прогретой до 55 °С предгибридизационной смеси не менее 15 мин, покачивая ванночку.
2. Добавляют ДНК, меченную радиоактивным изотопом, и оставляют на ночь при 55 С, покачивая ванночку.
3. Трижды по 15—20 мин промывают фильтры в 100—200 мл 3 х SSC/0,5% ДСН.
4. Помещают фильтры на фильтровальную бумагу, не высушивая их до конца во избежание необратимого связывания зонда.
5. Чтобы фильтры оставались влажными, заворачивают их в пленку Saran®.
6. Проводят радиоавтофафию с усиливающими экранами при -70 С в течение ночи.

- Читать далее "Мечение зондов для GP-ПЦР. 5-концевое мечение TS-ПЦР-зондов"

Оглавление темы "Выявление микроорганизмов и вирусов с помощью ПЦР":
1. Хранение фильтров после гибридизации. Полимеразная цепная реакция
2. Изготовление препаратов для ПЦР. Консервативные и типоспецифичные праймеры вируса папилломы человека
3. Статегия скрининга HPV. Полимеразная цепная реакция на мазках шейки матки
4. Типоспецифичная ПЦР на мазках шейки матки. Блот-гибридизация для выявления вируса папиломы шейки матки
5. Мечение зондов для GP-ПЦР. 5-концевое мечение TS-ПЦР-зондов
6. Особенности скрининга вируса папилломы. Требования к скринингу вируса папилломы
7. Перспективы выявления вируса папилломы. Молекулярные методы обнаружения микроорганизмов
8. Выявление кишечной микрофлоры молекулярными методами. Перенос колоний с селективной среды на твердую подложку
9. Гибридизация нуклеиновых кислот иммобилизованных на фильтрах с ДНК-зондами. Техника гибридизации с ДНК зондами
10. Применение ПЦР для обнаружения патогенных микроорганизмов. Техника выявления микроорганизмов методами ПЦР

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: